本文從水汽蒸發(fā)的規(guī)律出發(fā)，探討了超微量紫外可見分光光度計(jì)類儀器實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)的測(cè)試誤差、穩(wěn)定性問題產(chǎn)生的可能原因，并從測(cè)試樣品體積調(diào)整、移液器的選擇和點(diǎn)樣操作時(shí)間控制三個(gè)方面提供了建議。

一、自然界水汽蒸發(fā)的基本規(guī)律

       自然界，液態(tài)的水從液面、固體表面轉(zhuǎn)變成氣態(tài)并擴(kuò)散進(jìn)入大氣的過程，稱為水的蒸發(fā)^[1]。我國(guó)學(xué)者綜合了蒸發(fā)面的飽和蒸汽壓差、水面風(fēng)速、空氣相對(duì)濕度和環(huán)境氣溫4個(gè)主要影響因素后，在描述水蒸發(fā)規(guī)律的經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀罓栴D公式基礎(chǔ)上，建立了自由水面蒸發(fā)速率（或水日蒸發(fā)量，用E表示）的計(jì)算公式 ^[2]，即。

E = (e₀- e₁₅₀) ? f(W) ? [c + d(1-U²)^0.5] ? f(T₀-T₁₅₀)

       水面蒸發(fā)速率的單位為mm/d。1mm/d代表單位面積上的日蒸發(fā)液體高度為1mm。

       其中：

       水汽壓是指空氣中汽態(tài)水的分壓強(qiáng)。飽和水汽壓則是指在一定溫度下、一定體積空氣中，水汽達(dá)到最大限度含量時(shí)的分壓強(qiáng)。溫度升高，能使原已處于飽和狀態(tài)的空氣變得不飽和，還能進(jìn)一步容納更多的水汽，蒸發(fā)面上的蒸發(fā)重新出現(xiàn)，則飽和水汽壓因而隨之增大。e₀指水面飽和水汽壓強(qiáng)，e₁₅₀代表水面上方150cm高度空氣的飽和水汽壓強(qiáng)。二者之差（e₀- e₁₅₀）為飽和水汽壓差。飽和水汽壓差越大，蒸面發(fā)面上蒸發(fā)作用越強(qiáng)。

       f(W)為風(fēng)速函數(shù)，W代表水面上空150 cm 處風(fēng)速。水面風(fēng)速可加快空氣中水汽的擴(kuò)散和輸送，使水分子更容易逸出水面，蒸發(fā)加快。風(fēng)速大，即f(W)值大。

       U為空氣相對(duì)濕度，是某一溫度下空氣中的實(shí)際水汽壓與該溫度下空氣飽和水汽壓的比值。相對(duì)濕度較小時(shí)，水汽向外擴(kuò)散和交換較快，蒸發(fā)作用較強(qiáng)。

       f(T₀-T₁₅₀)為溫度函數(shù)，T₀、T₁₅₀分別指代水面、水面上方150 cm高處的氣溫。通常，水體溫度升高并高于T₁₅₀會(huì)加大蒸發(fā)速率。

       由道爾頓蒸發(fā)定律可知，水面上方空氣相對(duì)濕度小、水面風(fēng)速大、水體溫度高，可增大自由水面水蒸發(fā)率。這在用氮?dú)獯祾邇x進(jìn)行樣品濃縮時(shí)很容易體驗(yàn)到：增大高純度干燥氮?dú)饬髁?、采用加熱模式可增加水等溶劑的蒸發(fā)速率，提高樣品濃縮效率。而PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中則特別注意反應(yīng)孔的密封。因反應(yīng)體系水分蒸發(fā)，將造成樣品孔內(nèi)反應(yīng)組分濃度失衡，會(huì)破壞各孔擴(kuò)增均一性，甚至使PCR失敗。

       不同地域和季節(jié)，實(shí)驗(yàn)室的室溫、通風(fēng)對(duì)流條件、空氣相對(duì)濕度不同，水汽蒸發(fā)對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品影響的直觀程度不一。

       譬如，蛋白凝膠、轉(zhuǎn)印膜、新鮮組織等樣品長(zhǎng)時(shí)間直接暴露于空氣中，水分大量蒸發(fā)對(duì)實(shí)驗(yàn)潛在危害的防范意識(shí)已深入人心，人們通常會(huì)采取保濕保鮮處理措施應(yīng)對(duì)。微量紫外可見光度測(cè)試操作中，上樣體積通常不過數(shù)微升，點(diǎn)樣后放下檢測(cè)臂，20秒時(shí)間不到即可自動(dòng)完成測(cè)定和結(jié)果顯示，操作簡(jiǎn)單便捷，并不存在可影響到樣品測(cè)試精度和穩(wěn)定性的繁文縟節(jié)。其實(shí)，微量紫外測(cè)定操作與水分蒸發(fā)之間，看似微不足道，實(shí)則關(guān)系重大。                                              

       NanoDrop類微量光度計(jì)與NanoPhotometer N60超微量紫外可見光度計(jì)對(duì)體積2.0μL以下樣品常規(guī)濃度樣品測(cè)試光路生成所用方法完全不同（詳情可參考《Implen NanoPhotometer微量紫外可見光度計(jì)隆重上線》）。美國(guó)NanoDrop為代表的微量紫外分光光度計(jì)的測(cè)試光路的形成及有效維持取決于兩個(gè)關(guān)鍵因素：一是疏水性石英光學(xué)表面對(duì)樣品的低吸附性，二是樣品中水的表面張力作用。此二者共同作用可確保滴加到檢測(cè)窗表面的液滴自動(dòng)收縮形成飽滿圓珠。一旦光學(xué)表明因樣品污漬、鹽分、表面活性劑等殘留，點(diǎn)樣后液體無法形成半球型微珠，測(cè)試系統(tǒng)的穩(wěn)定性和可靠性將不復(fù)存在。

       而液體圓珠的生成后，隨之而來便是水汽蒸發(fā)與樣品濃縮的問題。

二、超微量紫外可見光度計(jì)測(cè)定中的樣品濃縮問題

       比表面積（specific surface area）是指物體表面總面積與其體積之比值。

       在材料科學(xué)、化學(xué)工程等領(lǐng)域，通常，粒子越細(xì)，比表面積（習(xí)慣上用單位質(zhì)量物料所具有的總表面積標(biāo)示，單位m2/g）越大。粒子物化活性，如氧化、溶解、蒸發(fā)、催化以及生理效應(yīng)等都因細(xì)粒子比表面積大而加速。生物學(xué)中，細(xì)胞的比表面積影響細(xì)胞物質(zhì)交換和代謝功能。小細(xì)胞通常具有較高的比表面積值，它們能夠更有效地從外部環(huán)境中攝取所需的養(yǎng)分并排出廢物。

       根據(jù)幾何學(xué)常識(shí)，在體積相同條件下，與圓柱體、橢球體、正方體比，球體的表面積是最小的，因而球體的比表面積也最小。

       自然界中，露珠一般形成于溫濕度適宜、晴朗無風(fēng)或微風(fēng)的夜晚，而隨著清晨氣溫升高和氣流攜帶水汽加速擴(kuò)散作用，很快會(huì)因蒸發(fā)而消失。因所附著物體表面及位置不同，露珠往往呈球形、半球型或水滴狀。

       球體體積=4πR3/3，故半球體的體積為2πR3/3。

       球體表面積=4πR2 ，則半球體的曲面部分的面積＝2πR2。

       將半球體的曲面表面積與半球體積（露珠或超微量測(cè)試樣品的容積）的比值視為半球體比表面積（等效于單位體積液體所占曲面表面積，單位為m2/μL），該比值=3/R，它與半球半徑成反比。液體體積增加，半球直徑加大，半球曲面比表面積降低。

表1 半球體積-半徑-曲面比表面積表

       譬如，半球體積（相當(dāng)于露珠或測(cè)試溶液體積）從2.0μL增加至4.0μL時(shí)，半球半徑增至原來的1.26倍，而半球曲面比表面積反而降至原來的0.79倍。

       將表1中半球球體體積(x軸)與曲面比表面積（y軸）作圖可得到半球曲面比表面積隨半球體積變化曲線。圖3中，比表面積曲線在0.5 – 2.0μL體積區(qū)間呈現(xiàn)為急劇俯沖下降段，2.0μL是一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，此后的曲線相對(duì)平緩，其中2.0μL – 5.0μL體積區(qū)間下滑坡度略大，5.0 – 10.0μL體積區(qū)間比表面積降幅收窄、降速減弱。

       水溶液直接暴露于空氣中，存在水分蒸發(fā)問題。在自由水面，蒸發(fā)速率相同條件下，半球體積大，半球曲面總表面積大，則相同時(shí)間內(nèi)因蒸發(fā)損耗的水汽絕對(duì)體積固然更大。但曲面比表面積曲線則告訴人們：半球體積較小，曲面比表面積反而較大，則相同時(shí)長(zhǎng)內(nèi)液體蒸發(fā)速率更高，單位體積液體的濃縮作用越明顯。因此，存在這樣一種事實(shí)：半球形液體體積少——單體液體曲面比表面積大——單位體積蒸發(fā)速率大——單位體積液體蒸發(fā)量大——溶液濃縮效應(yīng)大。簡(jiǎn)單概況起來就是，半球體積小，液體濃縮程度大。

       測(cè)試樣品因水汽蒸發(fā)所致濃縮效應(yīng)對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響，在常規(guī)比色皿測(cè)定中可能不明顯，但對(duì)于NannoDrop One C這類超微量紫外可見光度計(jì)，單樣品上樣體積僅2μL的測(cè)試操作，濃縮效應(yīng)對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響清醒則蔚為壯觀。而為減少小體積樣品測(cè)試結(jié)果因水汽蒸發(fā)樣品濃縮所致測(cè)試誤差，適度增加上樣體積不失為一個(gè)有效應(yīng)對(duì)方案。

       從圖3看，2.0μL – 5.0μL體積區(qū)間具有較高效（比表面積）費(fèi)（樣品消耗體積）比。相對(duì)而言，5.0μL – 6.0μL體積較2.0μL更理想。故有業(yè)內(nèi)資深人士吳鐵坤先生曾建議，NannoDrop系統(tǒng)單個(gè)測(cè)試樣品的點(diǎn)樣體積以5.0μL為宜，看來頗有見地。

       NannoDropOne C代表的微量紫外可見光度計(jì)的測(cè)試光學(xué)原理基本一致，即點(diǎn)樣后在檢測(cè)基座和檢測(cè)臂光學(xué)表面半球形液滴轉(zhuǎn)變?yōu)橐粭l垂直液柱，測(cè)試光路從液柱的中軸穿過來對(duì)樣品檢測(cè)。NannoDropOne的測(cè)試光程介于0.030 - 1.0 mm之間。而從表1可知，0.5μL - 2.0μL體積樣品的半徑介于0.62 - 0.98mm之間，當(dāng)測(cè)試光程為1.0mm時(shí)，液滴由半球體被輕度拉伸為垂直液柱并且在8秒鐘測(cè)試期間維持不變。因半球體轉(zhuǎn)換為柱體后，液體表面積增大的同時(shí)水汽蒸發(fā)速率隨之增加。

       而點(diǎn)樣體積達(dá)到3.0μL后，液滴半徑增至1.13mm以上，其自然半徑和高度足以充滿上下光學(xué)界面空間。檢測(cè)臂放下后無需拉伸液滴即可自然形成穩(wěn)定有效的檢測(cè)光路。此時(shí)，液體呈不規(guī)則半球體狀（近似于橢球體），曲面比表面積值變動(dòng)程度細(xì)微到可以忽略，故樣品在測(cè)讀期間，水汽蒸發(fā)速率依然維持在較低水平，濃縮問題得以較好控制。

       正是基于降低此類型儀器平臺(tái)測(cè)試運(yùn)行期間樣品水汽蒸發(fā)的考慮，為確保測(cè)試運(yùn)行可靠穩(wěn)定，微量紫外可見光度計(jì)對(duì)測(cè)試環(huán)境的溫度（5 – 35℃）、空氣相對(duì)濕度（20-80% R.H.）、通風(fēng)氣流條件都有要求。譬如，NannoDropOne C操作指南規(guī)定：1）儀器置于遠(yuǎn)離通風(fēng)口和排氣風(fēng)扇的位置以便有效減少樣品水汽蒸發(fā)；2）在建議的環(huán)境濕度范圍下運(yùn)行時(shí)，應(yīng)確保上樣體積足量，確保正確的液柱形成，以免蒸發(fā)劇烈干擾測(cè)試 ^[3]。

三、微量紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定中移液器的合理選型

       正所謂量變引起質(zhì)變的道理，當(dāng)樣品體積的量變達(dá)到一定限度后，與測(cè)試有關(guān)的各種內(nèi)外矛盾就會(huì)發(fā)生質(zhì)變而對(duì)測(cè)試精準(zhǔn)性產(chǎn)生制約。

       紫外可見光度檢測(cè)的測(cè)試光程從標(biāo)準(zhǔn)10mm降至0.03-1.0mm后，測(cè)試樣品體積驟減至2.0μL。此時(shí)，測(cè)試環(huán)境因素和內(nèi)部水汽蒸發(fā)規(guī)律共同作用下，樣品體積的改變就對(duì)測(cè)試結(jié)果有決定性影響力。因不同體積測(cè)試過程對(duì)水汽蒸發(fā)引起的樣品濃縮作用抵抗力不同，確保上樣體積的精準(zhǔn)、穩(wěn)定控制的同時(shí)，減少測(cè)試操作期間樣品水汽蒸發(fā)損耗，就成為微量樣品檢測(cè)中技術(shù)關(guān)鍵問題。

3.1  移液器上樣精度的控制

       NannoDropOne C微量紫外可見光度計(jì)的單個(gè)樣品測(cè)試體積可低至0.5–2.0μL。移液器系統(tǒng)固有移液誤差、手工點(diǎn)樣操作誤差的疊加，每個(gè)測(cè)試樣品的實(shí)際上樣體積存在差異是難免的，點(diǎn)樣后至儀器自動(dòng)測(cè)讀期間樣品因水汽蒸發(fā)量不同，樣品的濃縮程度不一，造成樣品測(cè)試穩(wěn)定性、精準(zhǔn)度下降，測(cè)試結(jié)果波動(dòng)。因此，在樣品體積許可情況下，一方面應(yīng)盡可能增加單個(gè)樣品的上樣體積，降低樣品水蒸發(fā)速率，減緩因液體濃縮對(duì)測(cè)試結(jié)果的干擾。另一方面，為精確移取2.0-5.0μL樣品，采用與測(cè)試體積匹配的移液量程，并盡量選擇高精度、高穩(wěn)定性的電動(dòng)或手動(dòng)移液器執(zhí)行移液操作。

表2  eppendorf Research Plus單道移液器移液精準(zhǔn)度表

       從Research Plus系列單道移液器移液精準(zhǔn)度數(shù)據(jù)看，移取2μL純水時(shí)移液誤差，0.1–2.5μL移液器與0.5–10μL移液器性能接近（約±2.0%），要遠(yuǎn)優(yōu)于另兩款2–20μL移液器（誤差±5.0%）。這說明，0.1–2.5μL與0.5–10μL兩款移液器與原廠高品質(zhì)吸頭組合情況下的移液精度，可以滿足NanoDrop OneC、Nanodrop lite Plus、L-SP-A、L-SP-B、Unano-1000和Nano-300微量紫外可見分光光度計(jì)的測(cè)試要求。這與Nanodrop用戶指南的要求一致。Research plus系列0.5 - 10μL 8道可調(diào)量程移液器移取2.0μL提及的誤差低于5.0%，與NanoDrop Eight、Aurora-8000八道微量紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定要求是匹配的。

       就現(xiàn)有的技術(shù)資料看，并非所有品牌移液器移液精度和誤差范圍達(dá)到上述微量紫外可見光度計(jì)穩(wěn)定可靠測(cè)定的要求。因此，移液器的選擇，是確保超微量樣品紫外光度測(cè)定穩(wěn)定性和測(cè)試精度的重要一環(huán)。

3.2 點(diǎn)樣操作時(shí)間控制

       如前所述，在水面蒸發(fā)速率相對(duì)穩(wěn)定條件下，相同體積的半球形液滴，測(cè)試期間的水汽蒸發(fā)總量與蒸發(fā)時(shí)間相關(guān)。點(diǎn)樣后暴露過程和測(cè)讀耗時(shí)長(zhǎng)，水汽蒸發(fā)量大，則樣品測(cè)試誤差大，數(shù)據(jù)可重復(fù)性、穩(wěn)定性低。

       誠(chéng)如《Implen NanoPhotometer微量紫外可見光度計(jì)隆重上線》文中所言，由于NanoDrop OneC（0.03mm/0.05mm/0.1mm/0.2mm/1.0mm五擋光程）、L-SP-HB（0.02mm/0.05mm/0.2mm/1.0mm三擋光程）和Unano-1000（1nm/0.2nm/0.05mm 三擋光程)、Nano300（0.2mm/1.0mm雙光程）等不同微量紫外光度計(jì)所設(shè)置的測(cè)試光程檔數(shù)不一，單個(gè)樣品完成全部光程掃描所需時(shí)長(zhǎng)不同，樣品測(cè)試時(shí)長(zhǎng)不同，這意味著相同體積樣品在不同機(jī)型上測(cè)試期間，水汽蒸發(fā)總量事實(shí)上存在著差異。

       此外，從實(shí)驗(yàn)操作而言，在完成精細(xì)移液點(diǎn)樣后，應(yīng)立即放下檢測(cè)臂啟動(dòng)樣品測(cè)讀，以縮短樣品在檢測(cè)窗暴露時(shí)的水汽自由蒸發(fā)時(shí)間，降低測(cè)試誤差。而這對(duì)于樣品測(cè)讀時(shí)間較長(zhǎng)的機(jī)型具有實(shí)實(shí)在在的意義。

       有研究人員曾反映， NanoDrop One單道微量紫外光度計(jì)測(cè)定核酸樣品的讀數(shù)誤差很大，分析主要原因是傳統(tǒng)單道手動(dòng)移液器的移液精度和穩(wěn)定性差，批內(nèi)樣品點(diǎn)樣體積波動(dòng)過大所致。故對(duì)于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)中核酸模板濃度和品質(zhì)評(píng)估，提出在8通道NanoDrop Eight測(cè)試平臺(tái)上、并采用8通道高精度移液器執(zhí)行批量點(diǎn)樣操作，有望提高qPCR測(cè)試數(shù)據(jù)精準(zhǔn)性和可靠性。

       因此，單通道精密移液器用于執(zhí)行單通道微量紫外光度計(jì)的點(diǎn)樣操作十分理想，但不適用于NanoDrop Eight、Aurora-8000及NanoPhotometer N120這類多通道微量紫外可見光度計(jì)采用。因?yàn)椴捎脝蔚酪埔浩髦饌€(gè)檢測(cè)位點(diǎn)依次點(diǎn)樣操作，造成檢測(cè)窗上第一個(gè)與最末一個(gè)樣品在點(diǎn)樣后水汽自由蒸發(fā)時(shí)長(zhǎng)上差異懸殊，認(rèn)為加大了同批次樣品測(cè)試結(jié)果的誤差?？蛇x擇0.5–10μL量程可調(diào)的Xplorer plus、Research plus這類多道電動(dòng)或手動(dòng)移液器，一次性完成多個(gè)樣品同步操作，可避免因水汽蒸發(fā)時(shí)長(zhǎng)不同因素加大測(cè)試誤差，有利于獲得高精準(zhǔn)的測(cè)試結(jié)果。

【參考文獻(xiàn)】

[1]申德裕.介紹計(jì)算水面蒸發(fā)量的幾種方法. 水利信息化，1996, (4) : 24-28

[2]毛海濤, 王正成, 王曉菊, 等. 北疆平原水庫(kù)水面蒸發(fā)模型的建立與關(guān)鍵參數(shù)確定. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2018, 34(6): 129-136.

[3] NanoDrop微紫外/可見光分光光度計(jì)用戶手冊(cè)（Revision B）