Beckman Optima XPN 100/90/80、Optima XE 90/80立式超速離心機(jī)通用的Type 45 Ti鈦合金材質(zhì)定角轉(zhuǎn)頭，額定工作容量6×94mL，是除Type 19角轉(zhuǎn)頭（6×250mL，19000rpm）外，單管處理量最大的超速轉(zhuǎn)頭。其實(shí)驗(yàn)應(yīng)用公開報(bào)道, 最早見于1978年澳大利亞費(fèi)爾菲爾德傳染病醫(yī)院病毒研究人員從甲型肝炎患者糞便中分離甲肝病毒的實(shí)驗(yàn)。
       截止至2023年9月30日, 從PubMed期刊數(shù)據(jù)庫中共采集到Beckman超速離心機(jī)Type 45Ti轉(zhuǎn)頭有關(guān)實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)336篇。從論文發(fā)表時間看, 1978 - 2003年為轉(zhuǎn)頭應(yīng)用的低谷徘徊期, 2004年起，實(shí)驗(yàn)應(yīng)用及產(chǎn)出進(jìn)入快速增長期。2004 - 2023這20年, 實(shí)驗(yàn)論文數(shù)量出現(xiàn)指數(shù)級躍升。若以5年為一統(tǒng)計(jì)周期，則2019 - 2023年刊文數(shù)量是前40年論文總數(shù)的1.6倍之多（見圖1）。                                              

      尤其值得關(guān)注的是，2014-2023這10年總計(jì)有286篇研究報(bào)告發(fā)表。所發(fā)期刊的2023年IFoid 分值（參考https://sci.justscience.cn/查詢數(shù)據(jù)）8.0分以上者達(dá)117篇。其中，包括一大批在Nature、Cell、Science、Nat Methods、Cell Discov、Nat Microbiol和Protein Cell等期刊發(fā)表的高水平論文（見表1）。

表1.  Type 45Ti轉(zhuǎn)頭有關(guān)部分實(shí)驗(yàn)應(yīng)用刊文統(tǒng)計(jì)（2019.01-2023.09）

       這其間高水平研究論文的占比之高，不免會引起人們的好奇與思考：如許之多有重大學(xué)術(shù)價值和廣泛影響力的研究項(xiàng)目中, 到底使用Type 45Ti轉(zhuǎn)頭分離何種實(shí)驗(yàn)對象？

       對上述117個實(shí)驗(yàn)報(bào)告的相關(guān)內(nèi)容歸類統(tǒng)計(jì)顯示：Type 45Ti轉(zhuǎn)頭的應(yīng)用對象主要包括蛋白質(zhì)（59例）、細(xì)胞外囊泡(EVs，44例) 和核糖體（8例）。此外，微粒體和脂質(zhì)等其它亞細(xì)胞組分、病毒類（慢病毒載體、甲病毒屬Getah病毒）應(yīng)用實(shí)例占比均低于2%(見圖2)。

      為此, 我們圍繞蛋白質(zhì)、細(xì)胞外囊泡(EVs)和核糖體分離有關(guān)應(yīng)用實(shí)例進(jìn)行了考察, 以了解超速離心機(jī)Type 45Ti角轉(zhuǎn)頭在其中所扮演的角色。

一、Type 45Ti轉(zhuǎn)頭在蛋白分離純化中的應(yīng)用

      與Beckman Type 45Ti轉(zhuǎn)頭應(yīng)用有關(guān)實(shí)例共計(jì)59例（BioRxiv平臺發(fā)表文章因IFloid無法查詢，不納入統(tǒng)計(jì)范圍）的蛋白研究存在多個維度。從蛋白在生命活動中的功能分，包括了細(xì)胞的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、微管運(yùn)輸、胞內(nèi)囊泡生物發(fā)生及轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白的翻譯-加工修飾-折疊及定位、蛋白復(fù)合體組裝及變構(gòu)、RNA轉(zhuǎn)錄和剪輯、DNA損傷修復(fù)和DNA轉(zhuǎn)座、細(xì)胞壁合成等細(xì)胞全流程生命活動。從蛋白分布定位看，有膜信號識別受體（如GPCRs）、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，陽離子選擇性通道等各種膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道、核糖體新生鏈復(fù)合物（RNCs）等。

      雖然不同實(shí)驗(yàn)所研究對象從真核生物（哺乳動物、果蠅）、原核生物（金黃色葡萄球菌、乳酸桿菌、恥垢分枝桿菌M. smegmatis等）、擬南芥、病毒（HIV-1, 噬菌體等）、螺旋體、瘧原蟲到DNA馬達(dá)各不相同，但研究思路、方法路線相似。無論是蛋白復(fù)合體組裝、配體-受體識別、蛋白與蛋白分子或蛋白-核酸結(jié)合、抗生素作用機(jī)制或細(xì)菌耐藥機(jī)制等，無不基于對蛋白分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)解析及與配體結(jié)合后構(gòu)象改變進(jìn)行的。統(tǒng)計(jì)顯示，上述59個研究項(xiàng)目中的36個項(xiàng)目的核心方法是用冷凍電鏡技術(shù)（Cryo-EM）對蛋白分子進(jìn)行了3D活性構(gòu)象的高分辨率分析。其余23個例是用X-ray晶體分析、電子顯微鏡技術(shù)、熒光偏振技術(shù)、單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移（single-molecule fluorescence resonance energy transfer，smFRET)技術(shù)等方法完成蛋白功能效應(yīng)與結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的分析（Structure-based mechanism）。

      蛋白組分制備技術(shù)有兩種途徑：一種是從豬腦、雞肝等動物組織器官中直接提取；第二種，也是最主要的途徑，是從細(xì)菌、酵母、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞中的一種或兩種異源表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行分離純化。異源表達(dá)體系中使用最多的是原核表達(dá)系統(tǒng)是E. coli BL21 (DE3)，占比44%，沙門氏菌、乳酸桿菌用的較少。真核類表達(dá)系統(tǒng)中，昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)10例占比17%（依次是Sf9、Hi5和Sf21），其次是哺乳動物細(xì)胞中HEK293細(xì)胞系（10.1%）、酵母表達(dá)系統(tǒng)（8.5%）等。

1. 代表性蛋白研究應(yīng)用實(shí)例

實(shí)例1 膜蛋白（受體）的提?。↗oshua A. Lees, 2023）

      藥物作用靶向位點(diǎn)、細(xì)胞之間的信號傳遞，大多是通過生物膜上的特殊膜受體蛋白實(shí)現(xiàn)的。約50%臨床藥物的靶向分子為膜蛋白。生物膜上的受體蛋白的表達(dá)豐度一般較低，直接在天然生物環(huán)境中難以提取到足量蛋白。由于蛋白質(zhì)翻譯后還需經(jīng)過修飾包括糖基化，脂肪?；土姿峄刃揎棽拍苷_折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)以及與胞膜整合和定位。異源表達(dá)的受體蛋白或存在錯誤修飾、折疊導(dǎo)致而不具備生物活性，或表達(dá)效率不夠高效。此外，膜蛋白疏水性強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)條件下難以維持膜蛋白正確構(gòu)象，使得對膜蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的解析相對滯后。

      G 蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)是真核生物中最大的膜蛋白超家族，分為A類視紫紅質(zhì)樣受體（Rhodopsin-like receptor）、B 類分泌素受體家族（Secretin receptor family）、C類代謝型谷氨酸受體（mGlu receptor）、D 類真菌交配信息素受體（Fungal mating pheromone receptor）、E 類 cAMP環(huán)腺苷酸受體（Cyclic AMP receptor）和F類卷曲蛋白受體 (Frizzled receptor, FZD)六大類。GPCR是由7個跨膜螺旋、胞外N端、胞內(nèi)C端、3個胞外環(huán)和3個胞內(nèi)環(huán)的保守結(jié)構(gòu)組成。胞外區(qū)域在結(jié)合激動性信號分子(如激素、神經(jīng)遞質(zhì)、趨化因子)后，受體構(gòu)象發(fā)生變化，受體胞內(nèi)區(qū)域招募并與G蛋白、P-arrestin等效應(yīng)蛋白、神經(jīng)遞質(zhì)以及激素等特異性配體結(jié)合，通過環(huán)腺苷酸(cAMP)信號通路、磷脂酰肌醇信號通路和鈣離子信號通路等調(diào)節(jié)體內(nèi)生理活動。

      孤兒受體（orphan GPCR，oGPCR）屬A類GPCR，因其內(nèi)源性配體尚未發(fā)現(xiàn)而得名。由于配體信息和配體結(jié)合靶點(diǎn)不明確，且孤兒受體與結(jié)構(gòu)已知GPCR同源程度較低，使得對孤兒受體的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能研究受阻。

      GPR61是一種與食欲相關(guān)的孤兒受體，是治療代謝和體重障礙的藥物靶標(biāo)。通過構(gòu)建N末端活性構(gòu)象（hGPR61-dnGαs/iN18）和非活性構(gòu)象（hGPR61ICL3BRIL）的重組蛋白進(jìn)行人GPR61的結(jié)構(gòu)表征，是對GPR61的選擇性小分子反向激動劑的結(jié)合位點(diǎn)和受體-配體相互作用方式研究的基礎(chǔ)。

      用于冷凍電鏡研究的孤兒受體GPR61構(gòu)建體表達(dá)蛋白的純化流程大致包括以下步驟：

【異源表達(dá)系統(tǒng)準(zhǔn)備】

人GPR61在活性構(gòu)象中的表達(dá)構(gòu)建體（hGPR61-dnGαs / iN18）和非活性構(gòu)象（hGPR61ICL3BRIL）的重組構(gòu)建體被轉(zhuǎn)化為DH10Bac E. coli感受態(tài)細(xì)胞以產(chǎn)生表達(dá)質(zhì)粒DNA，將其轉(zhuǎn)染到Sf9昆蟲細(xì)胞中以產(chǎn)生P0病毒。通過在無血清昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基（SF-900 III）中以2×10⁶活細(xì)胞/ ml的密度和0.5的MOI感染1L的Sf-9細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)。感染后當(dāng)細(xì)胞的活力為80-85%時收獲細(xì)胞。
【細(xì)胞膜制備】
收集培養(yǎng)的Sf-9細(xì)胞沉淀，在Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水中室溫孵育30分鐘，添加無EDTA的羅氏cOmplete蛋白酶抑制劑片劑后， 4℃下孵育30分鐘；
將細(xì)胞用高壓均質(zhì)機(jī)M-110L 15kPsi裂解細(xì)胞；
將細(xì)胞裂解物在Type 45 Ti角轉(zhuǎn)子中235000 ×g離心45分鐘，收集沉淀；
將沉淀重懸于500mM NaCl，50mM HEPES/pH 7.5中，添加無EDTA的Roche完全蛋白酶抑制劑片劑后重復(fù)上一步超速離心操作，收集沉淀；
【蛋白分離】
將沉淀重懸于含有150mM NaCl，50mM HEPES/pH 7.5,10%甘油的低鹽緩沖液中，添加無EDTA的Roche完全蛋白酶抑制劑片劑；
將粗膜提取液與1%月桂基麥芽糖新戊二醇（LMNG，Anatrace）和0.2%膽固醇半琥珀酸三鹽（CHS，Anatrace）溶解在500mM NaCl和50mM HEPES/pH 7.5,100μM TCEP中，添加無EDTA的Roche完全蛋白酶抑制劑片劑，孵育90分鐘；
【層析純化】
超速離心澄清裂解液，上樣值抗FLAG M2親和凝膠層析柱，4℃下孵育2小時；
用緩沖液（500mM NaCl，50mM HEPES/pH 7.5,100μM TCEP，0.5%LMNG和0.01%CHS）洗滌FLAG樹脂柱兩次；
使用緩沖液（0.25 mg/ml FLAG、0.01% LMNG、0.002% CHS、150mM NaCl、50mM HEPES/pH 7.5、100μM TCEP）洗脫；
將洗脫餾分合并，在離心過濾濃縮器中濃縮；
用含有0.001%LMNG，0.0002%CHS，150mM NaCl，25mM HEPES/pH 7.5,100μM TCEP的緩沖液在Superose 6尺寸排阻層析柱(SEC)上純化；
用SDS-PAGE分析餾分，收集合并單體GPR61對應(yīng)餾分。

實(shí)例2 從豬腦中純化動力蛋白激活蛋白(dynactin)（Sami Chaaban, 2022）

【組織準(zhǔn)備】
采集新鮮豬大腦，置于冰冷PBS中運(yùn)輸；
將2個大腦（約200g）用冰冷PBS沖洗2遍，手動去除腦干和主要血管后，用HB緩沖液（35mM PIPES-KOH/pH 7.2, 1mM MgSO4, 0.2mM EGTA，0.1mM EDTA，1mM DTT）再次沖洗腦組織；
【組織裂解】
將大腦置于添加有3片無EDTA蛋白酶抑制劑片和1.3mM PMSF的230mL HB緩沖液中，用Waring均質(zhì)器以均質(zhì)15秒-停頓15秒的方式進(jìn)行4個循環(huán)裂解組織細(xì)胞；
裂解物用JLA-16.250高速角轉(zhuǎn)頭16000rpm離心15min；
【蛋白分離】
上清液用Type 45 Ti轉(zhuǎn)頭4℃下45000rpm離心50分鐘，棄沉淀；
【層析純化】
在玻璃纖維過濾器和0.45μm過濾器中過濾上清液后，加載到250mL SP-Sepharose強(qiáng)陽離子交換層析柱上。柱預(yù)先經(jīng)AKTA Pure SP緩沖液（35mM PIPES/pH 7.2, 5mM MgSO4, 1mM EGTA, 0.5mM EDTA, 1mM DTT, 0.1mM ATP）平衡；
用含3mM KCl的SP緩沖液洗滌色譜柱后，以3倍柱體積250mM KCl的線性梯度洗脫。收集15 mS/cm附近的峰并用0.22μm過濾器過濾；
濾液加至用MonoQ緩沖液（35mM PIPES, 5mM MgSO4, 100μM EGTA, 50μM EDTA, 1mM DTT, pH 7.2）預(yù)平衡的MonoQ 16/10強(qiáng)陰離子交換層析柱上。用MonoQ緩沖液洗柱后，先以1倍柱體積的150mM KCl的線性梯度洗脫，再以10倍柱體積的350mM KCl的線性梯度洗脫。將39 mS/cm附近的洗脫峰餾分合并濃縮至3 mg/mL；
洗脫液轉(zhuǎn)移至用添加有5mM DTT、0.1mM ATP的GF150緩沖液洗(25mM HEPES/pH 7.2, 150mM KCl, 1mM MgCl2)預(yù)平衡的TSKgel G4000SWXL凝膠過濾柱上，將114 mL處的峰合并濃縮至3 mg/mL，分成3μL等分，用液氮速凍后-80℃儲存。

實(shí)例3 金黃色葡萄球菌耐藥機(jī)制研究（J. Andrew N. Alexander, 2023）

      耐甲氧西林抗生素的金黃色葡萄球菌簡稱金葡菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)對絕大部分β-內(nèi)酰胺類(β-lactamase)抗生素具有耐藥性。耐藥機(jī)制由Bla基因調(diào)控系統(tǒng)（由編碼β-內(nèi)酰胺酶的結(jié)構(gòu)基因BlaZ、啟動子調(diào)節(jié)基因BlaR1和轉(zhuǎn)錄抑制因子基因BlaⅠ組成）和MecA調(diào)控系統(tǒng)（由青霉素結(jié)合蛋白PBP2a的結(jié)構(gòu)基因MecA、上游啟動子調(diào)節(jié)基因MecR1和轉(zhuǎn)錄抑制因子基因MecⅠ組成）介導(dǎo)。兩套耐藥基因系統(tǒng)同源（BlaR1和MecR1基因序列35%一致；BlaI和MecI序列61%相同）, 且轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式相同。

      BlaR1和MecR1均為跨膜蛋白胞外部分為感受器結(jié)構(gòu)域, 含有青霉素結(jié)合位點(diǎn)。細(xì)胞內(nèi)為金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域, 具有裂解Blal及Mecl的功能。當(dāng)β-內(nèi)酰胺類抗生素等誘導(dǎo)劑結(jié)合到BlaR1的感受器結(jié)構(gòu)域, BlaR1被激活, 其胞內(nèi)鋅金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象改變, 水解抑制蛋白BlaⅠ水解并使之脫離BlaZ的啟動子結(jié)合位點(diǎn), BlaZ基因轉(zhuǎn)錄抑制解除, 表達(dá)產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶, 導(dǎo)致對β-內(nèi)酰胺類抗生素出現(xiàn)耐藥性。與此類似，MecI抑制因子通常結(jié)合在MecA基因的啟動子部位。在β-內(nèi)酰胺類藥物的作用下, MecR1被激活, 構(gòu)象改變, 誘導(dǎo)對MecⅠ蛋白水解并從啟動子上脫落, MecA基因得以表達(dá)合成β-內(nèi)酰胺類抗生素的作用靶點(diǎn)——合蛋白(penicillin-binding protein, PBPs) PBP2a。因PBP2a與β-內(nèi)酰胺類抗生素親和力極低, 對β-內(nèi)酰胺類藥物不敏感。而其所具有PBPs的完成細(xì)菌細(xì)胞壁合成功能, 卻能確保在抗生素作用下細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的完整性。

      Bla調(diào)控系統(tǒng)可以調(diào)控MecA基因的表達(dá), 并且可在數(shù)分鐘內(nèi)誘導(dǎo)PBP2a的產(chǎn)生。而MecA調(diào)控系統(tǒng)從激活到PBP2a合成則需要數(shù)小時之久。因此, Bla調(diào)控系統(tǒng)在許多MRSA菌株廣譜抗生素耐藥性方面作用至關(guān)重要。

      研究還發(fā)現(xiàn), BlaR1無需其他組分參與可直接自發(fā)切割BlaI（spontaneous autocleavage）啟動抗生素耐藥性機(jī)制。

      冷凍電鏡數(shù)據(jù)表明, 耐藥性BlaR1野生型與其F284A突變體（可有效結(jié)合β-內(nèi)酰胺類抗生素狀態(tài)）為異質(zhì)二聚體穿膜結(jié)構(gòu)。N端的鋅指金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域在胞內(nèi), C端的可結(jié)合β-內(nèi)酰胺的感受結(jié)構(gòu)域位于胞外側(cè)。兩個單體間通過胞質(zhì)側(cè)的α9螺旋結(jié)構(gòu)連接。胞外β-內(nèi)酰胺的感受結(jié)構(gòu)域與另一個單體胞外部分EL1相互作用。提示了BlaR1蛋白野生型胞外結(jié)構(gòu)域與β-內(nèi)酰胺類藥物抗生素間還存在活性位點(diǎn)競爭性排斥作用。

      研究表明, BlaR1中Ser283和Phe284間存在自切割環(huán)（autocleavage loop）, 這個曲環(huán)通常占據(jù)胞內(nèi)鋅金屬蛋白酶活性位點(diǎn)（F284A突變體中的自切環(huán)部位結(jié)構(gòu)完整, 而野生型結(jié)構(gòu)中該自切環(huán)存在未切割和切割兩種狀態(tài)）。自切割環(huán)卡位阻礙了鋅指金屬酶對BlaI、MecI轉(zhuǎn)錄抑制因子的水解, 而BlaI的二聚物狀態(tài)可穩(wěn)定結(jié)合在啟動子上。當(dāng)β-內(nèi)酰胺結(jié)合到BlaR1胞外側(cè)的感受結(jié)構(gòu)域時, 感受結(jié)構(gòu)域、胞內(nèi)酶活性結(jié)構(gòu)域均向細(xì)胞壁靠近和構(gòu)象的變化, 使自切環(huán)脫離鋅指蛋白酶活性位點(diǎn)。此活性位點(diǎn)的暴露方便了BlaI結(jié)合和水解, 耐藥基因表達(dá)抑制弱化, β-內(nèi)酰胺耐藥基因表達(dá)的增加，產(chǎn)生耐藥效應(yīng)。

      該研究項(xiàng)目中，針對β-內(nèi)酰胺類藥物受體蛋白BlaR1的cryo-EM分析和蛋白測序應(yīng)用，分別采用了兩種制備流程。

1）氨芐青霉素誘導(dǎo)下BlaR1構(gòu)象的cryo-EM分析

【菌體準(zhǔn)備】
4℃下離心收集菌體, 并重懸于添加了5mg/mL溶菌酶和20μg/mL DNase I的裂解緩沖液（150mM NaCl, 50mM HEPES/pH 7.5）中, 37℃攪拌、孵育1小時；
裂解液冰浴冷卻后，用高壓均質(zhì)器25000 psi下裂解菌體；
將裂解物以18600×g離心30分鐘；
【細(xì)胞膜制備】
上清液用Type 45 Ti角轉(zhuǎn)頭4℃、40000rpm離心1小時, 棄上清收集沉淀；
【膜蛋白分離】
用Dounce均質(zhì)器將膜沉淀重懸于添加1%（w/v）DDM的裂解緩沖液中，孵育1小時以提取膜；
用Type 45 Ti角轉(zhuǎn)頭4℃、40000rpm離心45 min后, 棄沉淀（不溶膜組分），收集上清；
上清經(jīng)0.45μm濾膜過濾后, 添加咪唑至濃度20 mM/pH 7.5；
【層析純化】
裝入經(jīng)平衡緩沖液處理的His-Trap HP層析柱中，分別用15mL的20mM、100mM咪唑緩沖液A各洗滌一次后, 用325 mM咪唑緩沖液A進(jìn)行洗脫；
洗脫餾分用填充Sephadex G-25脫鹽柱在緩沖液A中進(jìn)行脫鹽處理；
用離心濃縮器（100 kDa NMWL）濃縮；
【氨芐青霉素誘導(dǎo)變構(gòu)處理】
用BioComp梯度大師配制輕重兩組甘油梯度緩沖液：輕緩沖液組成包括5%（v/v）甘油, 150mM NaCl, 20mM HEPES/pH 7.5加或不加0.01% LMNG洗滌劑；重甘油梯度緩沖液組成包括 25%（v/v）甘油, 150mM NaCl, 20mM HEPES/pH 7.5；
對于氨芐青霉素處理樣品, 將BlaR1（F284A）在1 mM氨芐青霉素冰上孵育約15 min, 然后用250μM氨芐西林制備所有后續(xù)緩沖液；
將150-250μL的蛋白質(zhì)樣品添加于甘油梯度層上, 用SW 55 Ti水平轉(zhuǎn)頭4℃、55000 rpm離心8小時，用BioComp梯度分餾儀收集梯度餾分；
各餾分用Amicon Ultra (100?kDa NMWL)過濾器4℃下6000×g濃縮；
濃縮后蛋白組分收集于緩沖B（150?mM NaCl, 20?mM HEPES/pH?7.5）中, 用Micro Bio-Spin P-30進(jìn)行脫鹽處理。

2）BlaR1自切割環(huán)位點(diǎn)Edmann端測序用BlaI蛋白純化
【異源表達(dá)系統(tǒng)準(zhǔn)備】
將一個BlaI-麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）融合結(jié)構(gòu)克隆到BlaI的C端, 并具有Gly-Ser-Ser連接子。N-端用10xHis 標(biāo)簽設(shè)計(jì)BlaI-MBP結(jié)構(gòu), 克隆到pGEX-6P-1表達(dá)質(zhì)粒中, 并轉(zhuǎn)化大腸桿菌（DE3）細(xì)胞。DE細(xì)胞在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600約0.6 - 0.8時，用IPTG誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)蛋白并將培養(yǎng)溫度降低至20℃，過夜后收集菌體；
菌體在緩沖液3A（25mM Tris/pH 8.0和100mM NaCl）中裂解；
【膜蛋白分離】
細(xì)胞裂解液用Type 45 Ti轉(zhuǎn)頭4℃、40000rpm離心45 min；
【層析純化】
上清用0.45μm過濾器過濾后,添加咪唑至10mM濃度, 轉(zhuǎn)移至經(jīng)緩沖液3A中平衡的1mL His-Trap HP親和層析柱；
用10倍柱體積、濃度2%的緩沖液3B(50?mM Tris/pH?8.0, 500?mM imidazole, 100?mM NaCl）洗柱后, 以1ml/min流速用0-100%梯度洗脫；
洗脫組分用Amicon Ultra（30 kDa NMWL）的離心過濾器濃縮；
上樣至經(jīng)緩沖液3C（25mM Tris/pH 8.0,100mM NaCl）平衡處理的Superdex 75 10/300凝膠層析柱完成蛋白純化。

2. 蛋白分離中Type 45 Ti的應(yīng)用優(yōu)勢

       資料顯示，超速離心是保持蛋白活性構(gòu)象提取分離的必由之路。從操作流程上看, 無論取材于天然組織，或源于異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的重組蛋白，初始組織勻漿、細(xì)胞裂解液體積往往較大。對于疏水性的膜蛋白組分，往往需經(jīng)歷大容量低速離心收集細(xì)胞—細(xì)胞裂解液高速離心澄清—裂解上清或沉淀重懸液的超速離心分離的過程。而MBP融合蛋白、dynactin等可溶性蛋白組分，大體積裂解液直接上樣到Type 45 Ti轉(zhuǎn)頭，只需一步操作即可將蛋白與EVs、細(xì)胞器和細(xì)胞碎片分離，獲得蛋白的粗提溶液。因此，Type 45 Ti角轉(zhuǎn)頭超速離心功能和較大的容量，正好可以大有作為。
        不同蛋白理化屬性、下游應(yīng)用（如cryo-EM分析與Edmann測序分析）對樣品品質(zhì)要求雖有不同，但對于提取緩沖液，首先用Type 45Ti角轉(zhuǎn)頭超速離心沉淀處理是一致的基礎(chǔ)步驟。與核糖體、病毒類樣品分離不同，密度梯度離心環(huán)節(jié)在蛋白的提取分離中并非必須步驟。
        統(tǒng)計(jì)表明, 同時使用角轉(zhuǎn)頭沉淀、水平轉(zhuǎn)頭密度梯度離心兩步分離的報(bào)道實(shí)例占比約1/3。先用單管容量較大的Type 45Ti角轉(zhuǎn)頭將可提取溶液上清中蛋白組分沉淀，再將沉淀轉(zhuǎn)移至容量相對較小的水平轉(zhuǎn)頭進(jìn)行密度梯度分級。水平轉(zhuǎn)頭中，最常用的是容量6×38.5mL的SW 28或SW 32 Ti, 其次是容量6×13.2mL的SW 41 Ti、SW 40 Ti 或SW 32.1 Ti (6×17mL)。用容量較小的SW 60 Ti (6×4.0mL)進(jìn)行純化也有報(bào)道。蛋白組分密度梯度離心使用較多的梯度介質(zhì)是蔗糖。密度梯度離心耗時往往長達(dá)15-18小時, 對實(shí)驗(yàn)操作、工作效率都是一種挑戰(zhàn)。因此，大多數(shù)報(bào)道實(shí)例中，采用的是2-3種蛋白層析柱組合的辦法取代密度梯度離心實(shí)施提取液中蛋白的純化分離。 

（后續(xù)：Type 45Ti角轉(zhuǎn)頭在細(xì)胞外囊泡離心分離中的應(yīng)用）