關(guān)于重度抑郁癥(Major depressive disorder，MDD)病理機(jī)制，已有的神經(jīng)環(huán)路功能受損說(shuō)（杏仁核-內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)內(nèi)隱情緒調(diào)節(jié)環(huán)路、腹側(cè)紋狀體/伏隔核-內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)獎(jiǎng)賞神經(jīng)環(huán)路)、神經(jīng)遞質(zhì)說(shuō)、下丘腦–垂體–腎上腺軸應(yīng)激反應(yīng)功能調(diào)節(jié)受損說(shuō)，腸-腦軸微生物菌群代謝說(shuō)等廣泛流行，眾說(shuō)紛紜。

       理論來(lái)源于實(shí)踐，但一切理論須在實(shí)踐中來(lái)檢驗(yàn)和才能發(fā)展。

       氟西?。‵luoxetine）、西酞普蘭（Citalopram）等選擇性5-HT再攝取抑制劑（Selective Serotonin Reuptake Inhibitors，SSRIs)，可選擇性阻斷突觸前膜對(duì)5-HT的再攝取，通過(guò)間接提升突觸間隙5-HT濃度而維持神經(jīng)元的興奮性，具有抗抑郁作用。由此產(chǎn)生了MDD單胺能遞質(zhì)假說(shuō)。但后來(lái)的臨床實(shí)踐顯示，SSRIs治療起效慢，無(wú)法快速緩解抑郁癥狀及自殺風(fēng)險(xiǎn)，大多數(shù)接受SSRIs治療的患者未能實(shí)現(xiàn)癥狀和功能的完全恢復(fù)，并伴有難以預(yù)期的病情波動(dòng)。另外，約有1/3的患者對(duì)治療無(wú)效或抵抗，這類抑郁癥被稱為難治性抑郁癥（treatment-resistant depression，TRD） ^[1] 。而TRD患者復(fù)發(fā)率、致殘率和自殺率顯著高于普通MDD患者。這說(shuō)明，單胺遞質(zhì)假說(shuō)并沒(méi)有觸MDD發(fā)病機(jī)理和治療的本質(zhì)。

       氯胺酮（Ketamine）從1966年開始作為手術(shù)麻醉劑和鎮(zhèn)痛藥在臨床使用 ^[2] ，被發(fā)現(xiàn)具有極佳抗抑郁效果，成為最成功抗抑郁藥之一。它由一對(duì)同分異構(gòu)體R-氯胺酮 (arketamine)和S-氯胺酮 (esketamine)等量混合組成的外消旋混合物(racemic mixture)。而新上市的鼻噴霧劑艾司氯胺酮（Spravato）的藥效成份為其中的S-氯胺酮。這兩種藥的療效相當(dāng)，可在2-3個(gè)小時(shí)內(nèi)緩解減輕TRD患者癥狀和自殺傾向。

       氯胺酮類制劑的抗抑郁作用引起了科學(xué)界的極大關(guān)注。谷氨酸（Glutamate，Glu）是哺乳動(dòng)物腦內(nèi)最豐富興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，以大腦皮層和海馬含量最高，其神經(jīng)突觸占腦內(nèi)總突觸數(shù)量的60%-80%。一般認(rèn)為，氯胺酮通過(guò)阻斷離子型谷氨酸受體（ionotropic glutamate receptor，iGluR）中的NMDA受體N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體，造成細(xì)胞膜對(duì)Ca2+、K+、Mg2+等陽(yáng)離子通透性的改變，經(jīng)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)了抗抑郁活性。在谷氨酸能神經(jīng)系統(tǒng)-NMDA受體理論指導(dǎo)下，近年來(lái)，我國(guó)學(xué)者在此領(lǐng)域的多項(xiàng)研究取得突破性進(jìn)展。一是用遺傳學(xué)方法確定了艾司氯胺酮靶向N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)受體的GluN2A 亞基是抗抑郁作用的直接靶點(diǎn)，并不參與藥物致幻副作用的介導(dǎo)過(guò)程 ^[3] 。二是解析了快速抗抑郁效應(yīng)鏈條上與S-氯胺酮結(jié)合的離子型NMDA受體三維結(jié)構(gòu)，確定了S-氯胺酮在NMDA受體上的結(jié)合位點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)表明 GluN2A亞型中的 Asn614 位點(diǎn)與R-氯胺酮的親和力高于S-氯胺酮。因此，驗(yàn)證了R-氯胺酮比S-氯胺酮具有更持久、更安全抗抑郁作用的推測(cè) ^[4] 。 該項(xiàng)目研究結(jié)論對(duì)氯胺酮衍生物和代謝物設(shè)計(jì)靶向人類 NMDA 受體的新型抗抑郁藥具有重要引領(lǐng)意義 ^[5] 。三是，驗(yàn)證了在傳統(tǒng)皮質(zhì)-邊緣系統(tǒng)情緒調(diào)節(jié)神經(jīng)環(huán)路外一個(gè)全新效用腦區(qū)——外側(cè)僵核（lateral habenula, LHb)在抑郁癥發(fā)病和治療中的關(guān)鍵角色，以及低血藥濃度下超長(zhǎng)療效持續(xù)時(shí)間的全新機(jī)制 ^[6] 。此外，在谷氨酸神經(jīng)元、Ca2+通道之外，發(fā)現(xiàn)主要定位于大腦膠質(zhì)細(xì)胞Kir4.1鉀通道參與LHb腦區(qū)神經(jīng)環(huán)路對(duì)抑郁樣行為的調(diào)控 ^[7] 。星形膠質(zhì)細(xì)胞Kir4.1介導(dǎo)的“K+空間緩沖”功能，可清除胞外因神經(jīng)活動(dòng)累積的K+，從而維持大腦鉀離子穩(wěn)態(tài)并間接調(diào)控神經(jīng)元興奮性，揭示鉀通道Kir4.1作為快速抗抑郁藥物新靶點(diǎn)的有效性 ^[8] 。

       氯胺酮，即毒品“K粉”，有致幻、分離樣精神類癥狀等副作用和致癮性。只能在醫(yī)務(wù)人員監(jiān)督給藥，并在用藥后需至少接受兩個(gè)小時(shí)的健康監(jiān)測(cè)，且治療期間的大量哺乳期婦女無(wú)法給嬰兒哺乳。這類藥物安全性和使用便利性，群眾顯然不滿意。

       在目前對(duì)于MDD生物學(xué)基礎(chǔ)仍不明確的條件下，抗抑郁效應(yīng)所伴發(fā)的精神類毒副作用，更顯出谷氨酸能神經(jīng)系統(tǒng)-NMDA受體理論的不完善。科學(xué)界還需要對(duì)MDD病機(jī)及治療原理做更全面、更深入的理解。

一、抑郁癥GABA能中間神經(jīng)元調(diào)控理論基礎(chǔ)

       大腦是由各類神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞組成的超級(jí)復(fù)雜神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。大腦皮層的學(xué)習(xí)記憶及思維決策等高級(jí)認(rèn)知功能，主要依賴于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、興奮性谷氨酸神經(jīng)元（glutamatergic）和抑制性γ-氨基丁酸（GABA)能中間神經(jīng)元（GABAergic interneuron，GINs）間的協(xié)調(diào)作用及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中興奮性與抑制性的平衡。GINs大多為局部投射神經(jīng)元，擁有密集的軸突分支，可以靶向其他神經(jīng)元的樹突、胞體和軸突，這使它可以能夠調(diào)節(jié)整個(gè)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。GINs可通過(guò)攝取谷氨酸合成并釋放GABA，在調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性及同步震蕩中發(fā)揮關(guān)鍵作用。大腦皮層神經(jīng)回路中的生長(zhǎng)抑素神經(jīng)元(somatostatin，SST)和小清蛋白神經(jīng)元(parvalbumin，Pvalb)相關(guān)GINs的異常，可以引起興奮性與抑制性失衡。

       來(lái)自MDD患者遺體腦切片的免疫組織化學(xué)證據(jù)表明，包括大腦中GABA濃度降低，GABA-A型受體及催化谷氨酸轉(zhuǎn)化為GABA的關(guān)鍵酶——谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD)（GAD67)蛋白表達(dá)減少。在MDD患者背外側(cè)前額葉中，發(fā)現(xiàn)SST mRNA 表達(dá)下降。海馬、杏仁核、扣帶回等都發(fā)現(xiàn)了SST mRNA 表達(dá)降低和SST神經(jīng)元抑制功能降低。前額葉皮層(PFC)中GABA 合成酶GAD67mRNA 和蛋白水平減少，dlPFC中SST mRNA 表達(dá)顯著降低。

       臨床研究報(bào)告，MDD患者經(jīng)藥物、電休克治、經(jīng)顱磁刺激治療或認(rèn)知行為療法后，大腦內(nèi)GABA 含量升高，抑郁癥狀減輕 ^[9-10] 。

       通過(guò)化學(xué)遺傳學(xué)方法抑制小鼠前額葉皮層(medial prefrontal cortices, mPFC)的Gad1、Sst或Pvalb中間神經(jīng)元，能產(chǎn)生劑量和時(shí)間依賴性的抗抑郁行為反應(yīng)，并增加錐體神經(jīng)元的興奮性突觸后電流及c-Fos和VGLUT1的表達(dá)，表明GABA中間神經(jīng)元應(yīng)激誘導(dǎo)的病理生理過(guò)程與抑郁癥相關(guān)。而通過(guò)化學(xué)遺傳學(xué)方法激活Gad1、SST或Pvalb中間神經(jīng)元，則完全消除東莨菪堿的抗抑郁效果，并阻止了c-Fos+和VGLUT1的誘導(dǎo)。說(shuō)明東莨菪堿通過(guò)對(duì)GABA能中間神經(jīng)元的抑制而導(dǎo)致突觸間谷氨酸爆發(fā)后，刺激谷氨酸神經(jīng)元活動(dòng)并促進(jìn)mPFC神經(jīng)元突觸可塑性 ^[11] 。

       多維度的研究表明，前額葉皮層中GABA 能網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和功能完整性破壞，構(gòu)成MDD的病理生理學(xué)基礎(chǔ)。

二、GABA能中間神經(jīng)元相關(guān)抑郁癥腦皮質(zhì)類器官構(gòu)建基本原理

       大腦皮質(zhì)中的GINs占皮層神經(jīng)元數(shù)量20%，分布廣泛，其形態(tài)、基因表達(dá)、環(huán)路連接以及神經(jīng)電生理活動(dòng)模式等具有多樣性。正是GINs的異質(zhì)性使得人類大腦具有復(fù)雜精細(xì)的神經(jīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和高級(jí)認(rèn)知情感功能。探究GINs的起源及其多樣性的發(fā)育機(jī)制，是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域目前亟待解決的核心科學(xué)問(wèn)題之一。                                              

       GINs起源于位于妊娠中期胚胎發(fā)育的腹側(cè)端腦(ventral forebrain or subpallium) 【注：胚胎端腦起源于胚胎前腦泡，隨后進(jìn)一步發(fā)育成熟才形成由左右半球、半球聯(lián)合部級(jí)內(nèi)間腔，有完成解剖結(jié)構(gòu)的端腦)的神經(jīng)節(jié)隆起（ganglionic eminence, GE。屬于胚胎發(fā)育早起大腦的過(guò)渡性結(jié)構(gòu)，隨著大腦發(fā)育成熟而自然消失】。

       在GE中確定特定功能后，GINs會(huì)在人類胎兒發(fā)育的幾個(gè)月內(nèi)先作遠(yuǎn)距離切向遷移到皮質(zhì)層，繼而通過(guò)徑向遷移(radial migration)方式散布于整個(gè)大腦皮層，經(jīng)歷活動(dòng)依賴的成熟過(guò)程，最終整合到皮層神經(jīng)回路中。這一過(guò)程中的遺傳或環(huán)境因素?cái)_動(dòng)，可能導(dǎo)致皮層興奮性和抑制性失衡，被認(rèn)為與包括癲癇、自閉癥譜系障礙（ASD)等神經(jīng)精神障礙有關(guān) ^[12] 。GE根據(jù)解剖位置的不同分為內(nèi)側(cè)神經(jīng)節(jié)隆起(MGE)、外側(cè)神經(jīng)節(jié)隆起(Lateral ganglionic eminences, LGE)和尾神經(jīng)節(jié)隆起(CGE)。GE中的神經(jīng)祖細(xì)胞也包括放射狀膠質(zhì)細(xì)胞（RGCs)及中間神經(jīng)元祖細(xì)胞（IPCs)。祖細(xì)胞經(jīng)分裂后的演變成為神經(jīng)元根據(jù)基因表達(dá)差異可以進(jìn)一步區(qū)分為MGE，LGE及CGE細(xì)胞群。人腦中的MGE細(xì)胞主要分化為皮層及海馬中的GINs及皮層下腦區(qū)的GABA能GINs及膽堿能神經(jīng)元以及部分特異性表達(dá)CRABP1及NKX2-1的神經(jīng)元。MGE中間神經(jīng)元的多樣性在它們?cè)谌蕴幱谧婕?xì)胞時(shí)就已經(jīng)定義。而GINs多樣性的提前定義對(duì)于指導(dǎo)GINs準(zhǔn)確沿著遷移路徑完成遷移，進(jìn)而精準(zhǔn)地參與神經(jīng)環(huán)路建立極為重要。這個(gè)過(guò)程對(duì)于大腦皮層發(fā)育十分關(guān)鍵。與嚙齒類比較，人腦中的GINs不僅數(shù)量更龐大，而且類型更豐富。MGE起源的CRABP1+NKX2-1+以及CGE起源的SCGN+CALB2+兩種在人腦中特異性存在的中間神經(jīng)元前體細(xì)胞，不僅在發(fā)育過(guò)程中存在也存在于成年人的大腦皮層中 ^[12] 。

       由于人腦皮質(zhì)回路中的GINs關(guān)鍵發(fā)育過(guò)程主要發(fā)生在人類胚胎早、中期，人類胚胎實(shí)驗(yàn)材料的獲取大多數(shù)情況下都難以企及 ^[13] 。顯然，構(gòu)建類似于人類大腦前額葉皮層GABA 能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)和功能的類器官模型，只能遵循胚胎時(shí)期人腦皮質(zhì)本來(lái)的發(fā)生、發(fā)育路徑，采用人類多能干細(xì)胞來(lái)源含GINs腹側(cè)前腦類器官與含有谷氨酸能神經(jīng)元的前腦皮質(zhì)共培養(yǎng)，便于GINs分化完成后按自然規(guī)律從皮質(zhì)下層向大腦前額葉皮層的定向遷移，在皮層整合和進(jìn)一步發(fā)育。可喜的是，相關(guān)腦區(qū)特異性神經(jīng)球體及組裝、整合探索工作已由斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的研究團(tuán)隊(duì)于2017年宣布成功完成（可算是有可摸著過(guò)河的石頭了)。

三、 MIAOU標(biāo)準(zhǔn)視角下抑郁癥人腦類器官表征內(nèi)容

       基于學(xué)界對(duì)腦類器官的定義 ^[14-16] ，抑郁癥腦類器官應(yīng)是由hPSC 衍生的祖細(xì)胞、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在體外自組裝而成，并在一定程度上具備抑郁癥患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)組織發(fā)育特征的三維結(jié)構(gòu)細(xì)胞模型。

       好的類器官的定義標(biāo)準(zhǔn)是更忠實(shí)地概括人腦特征。艾倫腦科學(xué)研究所率先建立的綜合人腦圖譜，包含免疫組織學(xué)immunohistology、原位雜交in situ hybridization和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)transcriptomics，為類器官工程師提供寶貴的參考資源 ^[17] 。鑒于GINs特殊的起源、遷移和發(fā)育規(guī)律，大腦皮質(zhì)類器官理應(yīng)是腹側(cè)端腦和大腦皮質(zhì)兩個(gè)區(qū)域特異性腦類器官有機(jī)組裝衍生的類器官組裝體。

       歐盟《關(guān)于類器官及用途的最低限度信息標(biāo)準(zhǔn)》（MIAOU標(biāo)準(zhǔn))中，將類器官表征列為類器官實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化體系的元數(shù)據(jù)(metadata)內(nèi)容加以規(guī)范，以提高不同組織類器官來(lái)源、樣品批次研究間的可重復(fù)性(reproducibility)、可復(fù)制性(replicability)，促進(jìn)類器官生產(chǎn)穩(wěn)健性的同時(shí)，方便研究人員自信地與其他科學(xué)家分享研究經(jīng)驗(yàn)。MIAOU所列的類器官表征工作的內(nèi)容，包括結(jié)構(gòu)組學(xué)（基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)翻譯后修飾、細(xì)胞代謝、器官特有的生物標(biāo)志物等)、形態(tài)學(xué)以及視類器官用途而定的具體功能測(cè)讀等 ^[18] 。

       大量研究已證實(shí)，與健康人iPSCs來(lái)源的神經(jīng)元比，MDD患者iPSCs來(lái)源的各種類型的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,都出現(xiàn)神經(jīng)元線粒體功能受損、電生理特性以及包括 CACNA1C（鈣信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)）、SLC6A4（與5-HT的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)）和BDNF（突觸可塑性有關(guān)）等差異表達(dá)基因(DEGs)和神經(jīng)元的HTR2A、HTR7受體表達(dá)變化 ^[19] 。因此，對(duì)以GINs發(fā)育調(diào)控功能研究為目的腹側(cè)腦類器官模型,和以研究抑郁癥的病理學(xué)和治療學(xué)研究目的腹側(cè)腦類器官模型的表征，由于應(yīng)用場(chǎng)景不同，所用標(biāo)準(zhǔn)方法和要素應(yīng)該是有所區(qū)別的。后一種情況下，所構(gòu)建的模型理應(yīng)在抑郁癥有關(guān)的細(xì)胞功能、分子特征上有所體現(xiàn)。

        “Depressive patient-derived GABA interneurons reveal abnormal neural activity associated with HTR2C” 一文（為方便表述，以下簡(jiǎn)稱“ventral forebrain organoids一文”） ^[10] 與MIAOU標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)內(nèi)容（見(jiàn)：GABA能中間神經(jīng)元相關(guān)抑郁癥腦皮質(zhì)類器官生成和表征方法解析）的對(duì)照結(jié)果見(jiàn)表1。

表1  所引范文與MIAOU標(biāo)準(zhǔn)對(duì)類器官表征元數(shù)據(jù)的對(duì)比

       整體上，ventral forebrain organoids一文中對(duì)GIN神經(jīng)元生成的腹側(cè)前腦類器官表征要素，基本符合歐盟MIAOU標(biāo)準(zhǔn)表征技術(shù)要求。但在于對(duì)該類器官細(xì)胞抑郁癥表型的表征元數(shù)據(jù)有所欠缺。

       GAT1與GABBR2、GAD65與GAD67通常被視為GABA能神經(jīng)元標(biāo)志物。GAD67作為是人腦中早期大腦GINs發(fā)育的特異性GAD亞型。而GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GAT1)和GABA受體2（GABBR2)則是在GIN細(xì)胞膜上的表達(dá)兩種GABA轉(zhuǎn)運(yùn)受體。GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體主要負(fù)責(zé)突觸釋放的GABA的重?cái)z取，控制細(xì)胞外GABA的濃度，而調(diào)節(jié)下游神經(jīng)元的電興奮性。實(shí)驗(yàn)中關(guān)注了神經(jīng)元發(fā)育中的GAD67的表達(dá)，但對(duì)于GAT1與GABBR2，無(wú)論是基因轉(zhuǎn)錄層面、蛋白表達(dá)層面均未提及。此外，對(duì)于大量報(bào)告觀察到的MDD患者iPSC來(lái)源神經(jīng)元生物能量和線粒體代謝異常問(wèn)題，文中亦未涉及。

四、 GABA能中間神經(jīng)元相關(guān)抑郁癥腦皮質(zhì)類器官方法問(wèn)題

       2017年，斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院精神病學(xué)與行為科學(xué)系Fikri Birey等人的“Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids”在Nature發(fā)表。文中介紹在已經(jīng)建立的大腦皮層（pallium, hCS)區(qū)域特異性3D 神經(jīng)培養(yǎng)物（包含深層和淺層皮質(zhì)谷氨酸能神經(jīng)元以及星形膠質(zhì)細(xì)胞)基礎(chǔ)上，構(gòu)建了皮層下(subpallium, hSS)腦區(qū)神經(jīng)球體，經(jīng)hSS-hCS共培養(yǎng)生成了同時(shí)包含皮質(zhì)谷氨酸能神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及GINs的前腦球體的組裝球體（assembly of forebrain spheroids)，即組裝前腦類器官 ^[13] 。

       ventral forebrain organoids一文強(qiáng)調(diào)其類器官實(shí)驗(yàn)方案是基于Yuan等2020年發(fā)表研究報(bào)告中的方法 ^[20] 改進(jìn)而來(lái)，同時(shí)提及Birey等人的上述文章。

表2 兩篇報(bào)告中類器官生成過(guò)程元數(shù)據(jù)信息的對(duì)比

       對(duì)比兩篇報(bào)告中類器官組裝體的制備方法，從PSCs分化、生成區(qū)域性腦類器官到最后生成前腦類器官組裝體，主要步驟、關(guān)鍵控制時(shí)間節(jié)點(diǎn)基本一致，主要區(qū)別在于細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中培養(yǎng)基添加物的不同和實(shí)驗(yàn)總時(shí)間差異。據(jù)此，認(rèn)定兩個(gè)報(bào)告分別采用了兩種不同的方法生成了具有功能、胚胎學(xué)部位一致的前腦皮質(zhì)類器官組裝體似無(wú)爭(zhēng)議。

       但從兩篇報(bào)告中實(shí)驗(yàn)流程細(xì)節(jié)信息看，Birey等提供的方案顯然更有參考價(jià)值。

       ventral forebrain organoids一文，明確指出全套HPSC衍生類器官組裝體的培養(yǎng)操作源自用該實(shí)驗(yàn)室2020年開發(fā)成功的實(shí)驗(yàn)方法生成的。但這套自創(chuàng)實(shí)驗(yàn)流程方法與而Birey等人報(bào)告的實(shí)驗(yàn)協(xié)議和MIAOU技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比可知，實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)描述不僅僅是過(guò)于簡(jiǎn)略問(wèn)題，而是有諸多流程的元數(shù)據(jù)信息缺失，顯然與歐盟MIAOU對(duì)類器官實(shí)驗(yàn)信息披露要求不符。

       譬如,腦區(qū)類器官生成所用的HiPSCs克隆的篩選方法、傳代數(shù)控制、人體材料的遺傳背景控制、培養(yǎng)過(guò)程支原體檢測(cè)結(jié)果、E8培養(yǎng)基補(bǔ)充物的信息、傳代接種密度；從擬配體生成類器官過(guò)程中，培養(yǎng)基及所用補(bǔ)充物、是否使用了基質(zhì)、接種條件和培養(yǎng)基更換頻率、基質(zhì)單位體積的接種密度、培養(yǎng)基中每單位面積的基質(zhì)液滴體積、培養(yǎng)基用量、類器官擴(kuò)增時(shí)的解離方法。兩種類器官優(yōu)于分化、擴(kuò)增時(shí)序和時(shí)程不同，中間是否進(jìn)行過(guò)超低溫保存和復(fù)蘇，凍存和復(fù)蘇條件。

       此外，在類器官轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和單細(xì)胞測(cè)序環(huán)節(jié)，對(duì)類器官培養(yǎng)物的解離方法、單細(xì)胞懸液制備方法等，都缺少比較的描述信息。

       類器官病毒感染操作的技術(shù)細(xì)節(jié)和質(zhì)量控制，信息也不夠詳實(shí)。

       類器官實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化，是目前學(xué)界共同關(guān)注和亟待解決的技術(shù)問(wèn)題，理應(yīng)值得所有實(shí)驗(yàn)則重視。所謂言之無(wú)文，行而不遠(yuǎn)。當(dāng)研究工作中使用自主開發(fā)的技術(shù)方法時(shí)，更應(yīng)慎之又慎。這既確保不同實(shí)驗(yàn)室之間的類器官培養(yǎng)結(jié)果具有可比性，又可以研究人員進(jìn)行準(zhǔn)確而自信的技術(shù)交流，對(duì)推動(dòng)自主技術(shù)從實(shí)驗(yàn)室研究走向產(chǎn)業(yè)化發(fā)展有重要意義。而該文所提供的信息如此簡(jiǎn)略含糊，匪夷所思。較合理猜測(cè)是：這一套類器官實(shí)驗(yàn)流程還沒(méi)有真正固定成型，所生成的類器官模型穩(wěn)健性還有待完善。

五、關(guān)于抑郁癥人腦類器官建模的設(shè)計(jì)思路

       《素問(wèn)?脈要精微論》提出“頭者，精明之府”，這相當(dāng)于美國(guó)神經(jīng)科學(xué)家Paul D. MacLean 1960年提出的三腦理論（Triune Brain Theory）——人類大腦具有本能腦、情緒腦和理智腦的三重功能，三者間既功能獨(dú)立又互聯(lián)互通。

       與“三腦”相應(yīng)的結(jié)構(gòu)是腦干系統(tǒng)、邊緣系統(tǒng)和大腦皮層系統(tǒng)。實(shí)際上，人腦有數(shù)十個(gè)功能各異的腦區(qū)，腦區(qū)之間或相互激勵(lì)，或相互抑制，所組成的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)之復(fù)雜，得借助于現(xiàn)代人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)才能概括。但這樣一副神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖，還遠(yuǎn)不足以清楚闡釋抑郁癥等精神疾病的病理生理過(guò)程，目前還缺少如LHb、RMTg、DRN、NAc、VP等大量功能節(jié)點(diǎn)元件和神經(jīng)纖維聯(lián)系。

       抑郁癥人腦類器官模型的核心價(jià)值，在于具備MDD患者特異性遺傳背景，最大程度模擬特定腦區(qū)、腦神經(jīng)環(huán)路的組織結(jié)構(gòu)和生理功能特征。因此，構(gòu)建抑郁癥腦類器官，一要明確所模擬的功能腦區(qū)，二要關(guān)注神經(jīng)遞質(zhì)受體通路。

       資料顯示，內(nèi)側(cè)前額葉皮層(medial prefrontal cortices, mPFC)、海馬（hippocampus）是MDD患者臨床檢驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中報(bào)道最多的腦區(qū)。而伏隔核（nucleus accumbens，NAc）、腹側(cè)蒼白球（ventral pallidum，VP）、中腦腹側(cè)被蓋區(qū)（ventral tegmental area，VTA）、外側(cè)下丘腦（lateral hypothalamus，LH）和中縫背核（dorsal raphe nucleus, DRN）等大腦邊緣系統(tǒng)組件，則是獎(jiǎng)勵(lì)反饋 ^[21] 、疼痛 ^[22] 、藥物成癮 ^[23] 、睡眠和覺(jué)醒^{[ 24]}等生理過(guò)程的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制研究重點(diǎn)關(guān)注的腦區(qū)。多個(gè)研究項(xiàng)目通過(guò)神經(jīng)通路示蹤技術(shù)和電生理學(xué)方法記錄關(guān)聯(lián)腦區(qū)間神經(jīng)纖維投射，以闡述腦區(qū)間內(nèi)在調(diào)控邏輯。外側(cè)韁核（LHb）為連接前腦邊緣系統(tǒng)（limbic system）和中腦單胺核團(tuán)的樞紐，是大腦“反獎(jiǎng)勵(lì)中樞”，與中腦“獎(jiǎng)勵(lì)中心”的單胺核團(tuán)相互拮抗，抑制邊緣系統(tǒng)的獎(jiǎng)賞效應(yīng)導(dǎo)致抑郁發(fā)生 ^[6] 。無(wú)論是對(duì)藥物作用機(jī)制的解釋，還是大腦特定腦區(qū)、神經(jīng)回路功能的研究，應(yīng)跳出單一腦區(qū)內(nèi)、神經(jīng)元的視野，將所觀察到的靶點(diǎn)受體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞、電生理特征和神經(jīng)元突觸可塑性（synaptic plasticity）等局部現(xiàn)象，還原到人腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)環(huán)境中，判斷局部節(jié)點(diǎn)內(nèi)的變化區(qū)域特異性變化還是全局性改變，同時(shí)判斷這種變化對(duì)神經(jīng)回路中其它功能節(jié)點(diǎn)的影響。

       中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT受體有多種亞型，包括5-HT1、5-HT2、5-HT3、5-HT4、5-HT5、5-HT6及5-HT7，除5-HT3屬配體門控離子通道外，其余均為G蛋白偶聯(lián)受體。NMDA受體在調(diào)節(jié)神經(jīng)元的樹突、軸突結(jié)構(gòu)發(fā)育，參與突觸可塑性和神經(jīng)元回路的形成起著關(guān)鍵作用。NMDA受體是由NR1、NR2B、NR2B、NR2C、NR2D、NR3A和NR3B等不同亞基構(gòu)成的異四聚體（heterotetramers）。功能性NMDA受體至少含有一個(gè)NR1亞基和一個(gè)NR2亞基。由NR1與NR2組成的復(fù)合物體中，兩個(gè)NR1和NR2也可能是異質(zhì)的。此外，NR1、NR2和NR3還可組裝成NR1/NR2/NR3的聚合體。不同腦區(qū)NMDA受體亞基組成并不一樣，離子通道的選擇性存在明顯差異，介導(dǎo)的電流形式不同 ^[25] 。在哺乳動(dòng)物腦組織內(nèi)，NR2A、NR2B、NR2C和NR2D亞基的NMDR受體分布與腦皮質(zhì)、海馬、前腦、間腦和腦干等不同腦區(qū)。NMDA受體多樣性和空間分布異質(zhì)性，定義不同腦區(qū)調(diào)控功能多樣性。

       GABA通過(guò)離子型GABAA受體和代謝型GABAB受體介導(dǎo)神經(jīng)元的抑制。GABAA受體屬配體門控離子通道受體，具有存在苯二氮卓類和巴比妥的結(jié)合位點(diǎn)，受體激活后氯離子通道開放，氯離子內(nèi)流使突觸后膜超極化，引起快抑制性突觸后電位，發(fā)揮鎮(zhèn)靜與抗焦慮功能。GABAB受體屬G蛋白偶聯(lián)受體家族，分布于中腦和脊髓。在GABA能和谷氨酸能神經(jīng)元突觸前膜表達(dá)，可通過(guò)抑制Ca2+通道抑制囊泡融合和神經(jīng)遞質(zhì)釋放。而突觸后激活可導(dǎo)致G蛋白門控內(nèi)向整流鉀（G-protein-gated inwardly rectifying potassium,GIRK)通道介導(dǎo)的神經(jīng)元超極化，控制神經(jīng)元的興奮性。

       大腦內(nèi)部功能分區(qū)的多樣性，神經(jīng)遞質(zhì)受體組成類型空間分布的特異性，對(duì)腦類器官的腦區(qū)選擇、功能的表征和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解讀，應(yīng)基于腦區(qū)和區(qū)域特異性受體進(jìn)行。而忽視大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的作用，脫離具體靶位討論藥物作用機(jī)制和藥效靶點(diǎn)，難免以偏概全之嫌，甚至引出不恰當(dāng)?shù)慕Y(jié)論。

        在目前MDD病理機(jī)制尚不清晰條件下，在偌大的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中，選擇哪個(gè)功能節(jié)點(diǎn)作為MDD腦類器官模擬靶標(biāo)，尚無(wú)足夠可參考經(jīng)驗(yàn)。

       按先易后難、先簡(jiǎn)單后復(fù)雜的指導(dǎo)思想，避開mPFC等大腦皮層高級(jí)神經(jīng)中樞而選擇神經(jīng)纖維組成、神經(jīng)纖維投射相對(duì)簡(jiǎn)單的皮質(zhì)下中樞，將極大降低類器官構(gòu)建和后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果解析的技術(shù)難度。而基于實(shí)踐與理論辯證觀，從已驗(yàn)證的快速抗抑郁效用部位、效用靶點(diǎn)和神經(jīng)環(huán)路機(jī)制出發(fā)設(shè)計(jì)類器官，是可靠穩(wěn)妥、事半功倍的選項(xiàng)。

       譬如，艾司氯胺酮通過(guò)阻斷GluN2A NMDA受體通道，抑制小鼠、人體間腦LHB的簇式放電，而解除其對(duì)“獎(jiǎng)勵(lì)中心”的抑制 ^[6] ，逆轉(zhuǎn)抑郁表現(xiàn)。選擇LHb作為腦類器官的核心靶標(biāo)，構(gòu)建LHB腦區(qū)腦類器官,可用于GABA受體、NMDR受體、5-HT受體靶點(diǎn)藥物、不同治療方法對(duì)神經(jīng)元形態(tài)與功能改變進(jìn)行觀察。在此基礎(chǔ)上再構(gòu)建包含LHB的神經(jīng)環(huán)路的類器官組裝體，如LHb - DRN、LHb - VP、LHb-RMTg、LHb-VTA、LHb-NAc、LHb-Hippo，特別適合在腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的大背景下，研究“反獎(jiǎng)勵(lì)中心-獎(jiǎng)勵(lì)中心”的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制和網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)聯(lián)動(dòng)反應(yīng)，將助于系統(tǒng)而清晰的闡述抑郁癥病理生理基礎(chǔ)、抗抑郁治療機(jī)制及抗抑郁治療毒副作用發(fā)生原理。

六、關(guān)于神經(jīng)藥理學(xué)家眼中的“完美”抗抑郁藥物問(wèn)題

       目前，科學(xué)界還缺少人腦神經(jīng)遞質(zhì)受體分布圖譜和人腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖譜可靠?；趥€(gè)別腦區(qū)獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并不能代表整個(gè)大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的整體性反應(yīng)。由于正常成人、DD患者與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基因組表達(dá)調(diào)控的差別，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)個(gè)節(jié)點(diǎn)功能區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)受體、轉(zhuǎn)運(yùn)體分布的異質(zhì)性，對(duì)某一局部觀察到的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，切換到神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)另一節(jié)點(diǎn)后，極有可能是弱化、陰性甚至相反變化。正如人類大腦內(nèi)部不停地前進(jìn)與后退、情緒失控和保持理智之間作出選擇那樣，氯胺酮在抑制LBb神經(jīng)元興奮性的同時(shí)，在網(wǎng)絡(luò)中另一個(gè)或多個(gè)節(jié)點(diǎn)同時(shí)發(fā)出其它反應(yīng)。而藥效與精神副作用正是人腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)氯胺酮局部給藥作出一種客觀綜合反應(yīng)的輸出結(jié)果。

       如同硬幣的正反雙面，凡事有利必有弊。正如“按下葫蘆浮起瓢”的道理，單一成份藥物作用于大腦復(fù)雜神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)后的整體反應(yīng)輸出，還存在太多未知。收獲療效而消除全部副作用，從哲理上講，恐怕不易實(shí)現(xiàn)。

       聯(lián)想到人類抗艾滋病的雞尾酒療法，采用多種組分組合或采用復(fù)雜化學(xué)組分的中藥及中藥復(fù)方，從多個(gè)節(jié)點(diǎn)、多個(gè)靶標(biāo)和神經(jīng)環(huán)路同時(shí)發(fā)力，可能更有利于創(chuàng)造出完美的抗抑郁效果。

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