早在公元前2000多年前，兩河流域的古人發(fā)明了玻璃生產(chǎn)技術(shù)。美國(guó)金屬學(xué)會(huì)（ASM）將此評(píng)為人類歷史上“10個(gè)最偉大材料事件”之一。玻璃是人類使用歷史最長(zhǎng)、最廣泛的非晶態(tài)物質(zhì)，是故，非晶態(tài)材料又稱為玻璃態(tài)材料。然而，材料的玻璃態(tài)本質(zhì)是什么，科學(xué)界并無(wú)定論。為此，2005年《Science》將其列入21世紀(jì)重大科學(xué)問(wèn)題 ^[1] 。

1、生物樣本玻璃化保存技術(shù)的概念

       玻璃態(tài)物質(zhì)內(nèi)部具有與液體分子無(wú)序排列相似的特點(diǎn)，但分子不能自由運(yùn)動(dòng)。材料內(nèi)部粘滯系數(shù)極大，無(wú)流動(dòng)性，具有晶態(tài)固體般的硬度，是不同于晶體、液體的“非晶態(tài)固體”。材料玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變，反映的是材料分子鏈局部的微布朗運(yùn)動(dòng)形式轉(zhuǎn)變，有材料特異性和溫度依賴性。當(dāng)溫度降低至特定溫度以下，材料分子的整體運(yùn)動(dòng)處于“凍結(jié)”狀態(tài)，只有分子鏈上的原子或基團(tuán)可以在其平衡位置振動(dòng)，材料整體表現(xiàn)為剛性固體狀，類似于玻璃。反之，當(dāng)溫度上升至特定溫度以上，分子鏈整體運(yùn)動(dòng)雖依舊凍結(jié)，但分子側(cè)基、支鏈等開始出現(xiàn)轉(zhuǎn)動(dòng)、移動(dòng)和搖擺運(yùn)動(dòng)等變化，材料整體表現(xiàn)出高彈性，稱為高彈態(tài)或橡膠態(tài)。非晶態(tài)材料在玻璃態(tài)、高彈態(tài)間的轉(zhuǎn)變，稱為玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變(glass transition)。轉(zhuǎn)變發(fā)生的溫度，稱為玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(glass transition temperature, Tg)。Tg為一區(qū)間值，有Tg起點(diǎn)、終點(diǎn)和中點(diǎn)之分，習(xí)慣上可用中點(diǎn)溫度指代特定體系的Tg值。                                             

       通常，轉(zhuǎn)變前后材料的多種多物理性質(zhì)，如體積，膨脹系數(shù)、比熱容、導(dǎo)熱系數(shù)、介電常數(shù)等會(huì)發(fā)生劇變。當(dāng)材料溫度低于Tg時(shí)，粘度極高（η＞1014 Pa?s），內(nèi)部分子運(yùn)動(dòng)阻力極大，分子擴(kuò)散速趨于停止，各種化學(xué)反應(yīng)速率極低。體系內(nèi)自由體積、內(nèi)能和熵等熱力學(xué)屬性保持穩(wěn)定。故玻璃態(tài)體系具有高物理和化學(xué)穩(wěn)定性 ^[2] 。而溫度高于Tg時(shí)，材料開始向高彈態(tài)轉(zhuǎn)變, 分子鏈段的運(yùn)動(dòng)解凍，體系粘度驟降，分子擴(kuò)散系數(shù)上升，各種反應(yīng)速率加快, 體系內(nèi)部理化穩(wěn)定性降低。

       基于這一原理，食品經(jīng)玻璃化技術(shù)處理后，食品的質(zhì)構(gòu)、紋理、微生物活動(dòng)、酶活化等引起食品變質(zhì)的理化反應(yīng)極其緩慢，有利于食品貯藏保鮮。而制藥生產(chǎn)中，采用玻璃化技術(shù)優(yōu)化配方，可延長(zhǎng)藥物保質(zhì)期 ^[3] 。

       生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，樣品材料低溫保存的玻璃化技術(shù)應(yīng)用，同樣引發(fā)了科學(xué)界高度關(guān)注和大量探索實(shí)踐。

2、玻璃化生物樣本保存技術(shù)的重要價(jià)值

       在低溫保存過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)外冰晶形成與生長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致機(jī)械損傷和氧化應(yīng)激效應(yīng)，破壞細(xì)胞內(nèi)外結(jié)構(gòu)與功能，如微管斷裂、DNA片段化、RNA降解及核蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)改變 ^[4] 。冰晶所導(dǎo)致細(xì)胞損傷，是冷凍保存期間細(xì)胞死亡的重要原因 ^[5] 。許多研究報(bào)道了冷凍保存誘導(dǎo)的分子細(xì)胞死亡相關(guān)的激活途徑，包括腎細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞、臍帶血、精子、卵母細(xì)胞、卵巢組織、血管組織等，涉及細(xì)胞膜、細(xì)胞核和線粒體等起始損傷位點(diǎn) ^[6] 。鑒于所檢測(cè)到的各種細(xì)胞的壞死和凋亡，通常是在復(fù)溫后的24小時(shí)內(nèi)逐漸顯現(xiàn)，故把這種細(xì)胞死亡現(xiàn)象稱為冷凍保存誘導(dǎo)的遲發(fā)細(xì)胞死亡（cryopreservation-induced delayed-onset cell death, CIDOCD），造成細(xì)胞復(fù)蘇后活力和恢復(fù)率降低 ^[7] 。

       凍傷雙因素假說(shuō)（A Two-Factor Hypothesis of Freezing Injury）創(chuàng)立者之一、美國(guó)冷凍生物學(xué)家彼得?馬祖爾(Peter Mazur)。發(fā)現(xiàn)，當(dāng)冰晶體積達(dá)到卵母細(xì)胞內(nèi)部空間的16%就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。要防止細(xì)胞死亡，應(yīng)完全避免細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶。將細(xì)胞保存溶液玻璃化處理，是避免冰晶生長(zhǎng)的理想解決辦法 ^[8] 。

       生物樣本低溫保存中的玻璃化（vitrification）技術(shù)理念，由瑞士科學(xué)家巴希爾?J?呂耶特（Basile J. Luyet）于1937年的論文“The vitrification of organic colloids and of protoplasm”最早提出。其原理是通過(guò)超快速冷凍方法將液體直接轉(zhuǎn)化為膠體非晶態(tài)固體，避免保存液中冰晶生成。1985年，美國(guó)科學(xué)家首次將這一理念應(yīng)用于小鼠胚胎的冷凍保存取得成功。此后，玻璃化技術(shù)開始大量用于哺乳動(dòng)物胚胎的低溫保存研究應(yīng)用。1997年，玻璃化保存的人體胚胎與輔助生殖技術(shù)（assisted reproduction technology, ART）結(jié)合妊娠獲得成功 ^{[9 ]} ，推動(dòng)了玻璃化冷凍技術(shù)的應(yīng)用的深入，提升臨床妊娠成功率，提高了不孕不育人群的幸福感。

       細(xì)胞保存溶液轉(zhuǎn)化為非晶態(tài)玻璃后，水分子運(yùn)動(dòng)受限，冰晶生長(zhǎng)受阻，降低了冰晶致?lián)p風(fēng)險(xiǎn)，活細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性和功能活性均得到有效維持 ^{[2, 10]} ，因此，在哺乳動(dòng)物胚胎組織和器官長(zhǎng)期保存中有巨大應(yīng)用潛力 ^[11] 。 

        概括起來(lái)，組織細(xì)胞樣品玻璃化的積極意義主要有以下三方面。

1）阻遏胞內(nèi)冰晶的生成

       胞內(nèi)完成玻璃化轉(zhuǎn)變后，細(xì)胞器與生物大分子組成的固態(tài)網(wǎng)狀物，將胞內(nèi)空間分割出分散、互不連通的孔穴?？籽ㄆ骄讖酵ǔ２坏?10 nm，內(nèi)部與殘留的液體（含有水、離子物質(zhì)及代謝物等小分子物質(zhì)） ^[2] 。這些納米尺度的孔穴內(nèi)，已有相當(dāng)比例的水分子與冷凍保護(hù)劑分子發(fā)生鍵合，殘余水分子無(wú)法自由擴(kuò)散和大規(guī)模積聚，晶胚發(fā)育受損，有效阻抑胞內(nèi)冰晶的大量生成 ^[12] 。

2）阻抑生物分子的擴(kuò)散

       胞內(nèi)膠體玻璃的粘度可高達(dá)100M Pa.s ^[2] ，而溫度極低，水分子熱運(yùn)動(dòng)動(dòng)能極低，各種活性大分子、物質(zhì)的擴(kuò)散、主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)停滯，細(xì)胞新陳代謝活動(dòng)有關(guān)的基本化學(xué)和生物反應(yīng)陷入停頓 ^[13] 。

3）結(jié)構(gòu)維穩(wěn)與活力保鮮

       膠體玻璃化體系的物理化學(xué)保持高度穩(wěn)定，細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換的停止，細(xì)胞各生物組分的組成與細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)得以固化，有效地保存了細(xì)胞功能活力和恢復(fù)能力，可使組織細(xì)胞“青春永駐”。

3、生物樣本玻璃化保存的技術(shù)要求和實(shí)施方法

       幾乎所有的物質(zhì)在一定條件下都可以轉(zhuǎn)換為玻璃態(tài)。常見的非晶態(tài)材料制備方法是熔體急冷法。以玻璃生產(chǎn)為例，先將玻璃制作原料加熱熔融成液體后，快速冷卻至特定Tg，即獲得固化的非晶態(tài)玻璃。同樣地，將過(guò)冷細(xì)胞保存液以極快速度降溫至溶液Tg以下，可跨越結(jié)晶過(guò)程直接轉(zhuǎn)化為玻璃態(tài)。這期間，不僅要有效控制細(xì)胞脫水程度，還需實(shí)現(xiàn)溶液極速冷卻，在最短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)樣品溫度從平衡熔化溫度（equilibrium melting temperature, Tm）和均相成核溫度（homogeneous nucleation temperature, Th）直降到玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg）以下。

       一般而言，組成固定的材料，Tm、Th和Tg是恒定的。譬如，純水Tg為-137℃。但對(duì)于細(xì)胞保存溶液，通常含有鹽、氨基酸、蛋白質(zhì)和低溫保護(hù)劑，組分繁雜而不統(tǒng)一，Tm、Th和Tg會(huì)隨細(xì)胞類型、溶液組分構(gòu)成不同而變化。其中，細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量以及冷卻過(guò)程的脫水程度決定著樣本溶液的Tg。樣本的蛋白質(zhì)濃度和脫水程度較高，則Tg較高。相對(duì)于純水，細(xì)胞低溫培養(yǎng)基Tg值-123℃顯著高于純水Tg ^[12] 。用含10% DMSO的CryoStor10保護(hù)溶液制備0-50%（W/W）濃度梯度的牛血清白蛋白緩沖液，在以2℃/min降溫速率冷卻至-150℃過(guò)程中，差示掃描量熱（DSC）檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著牛血清白蛋白濃度從0%-10%-20%-30%-40%-50%漸次遞增，混合溶液Tg（中點(diǎn)值）從-72.9℃一路飆升至-22.9℃ ^[2] 。

       不同類型的組織細(xì)胞，蛋白含、核酸和脂質(zhì)等含量不同，玻璃化轉(zhuǎn)化實(shí)施條件會(huì)必然存在差異。與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相比，細(xì)菌胞內(nèi)具有更高蛋白質(zhì)含量，故菌體Tg值高于動(dòng)物細(xì)胞。不同物種（譬如人類和馬）精子冷凍保存中胞內(nèi)玻璃化轉(zhuǎn)變Tg也存差異。由于卵母細(xì)胞膜脂肪酸組成中的多不飽和脂肪酸較少，卵母細(xì)胞胞膜對(duì)冷凍敏感性高，與胚胎相比，卵母細(xì)胞比胚胎冷凍保存難度更大 ^[14] 。此外，冷凍保護(hù)劑濃度高，對(duì)應(yīng)樣品的Tg值相對(duì)較高。精子具有非常致密細(xì)胞質(zhì)，游離水含量少，精子玻璃化過(guò)程可大幅降低CPA運(yùn)用濃度。這與適用于卵母細(xì)胞和胚胎的方案中隊(duì)較高濃度CPA的依賴有根本區(qū)別 ^[2] 。

       在細(xì)胞保存溶液體系中，胞質(zhì)因溶質(zhì)濃縮、細(xì)胞器與生物大分子堆積，密度增大，粘度升高，呈膠體狀態(tài)。故細(xì)胞的Tg通常高于胞外溶液的Tg。在降溫過(guò)程中，胞內(nèi)要先于胞外溶液完成玻璃化轉(zhuǎn)變。含DMSO（4.5% w/v）的乳酸桿菌樣品的DSC測(cè)試顯示，細(xì)胞內(nèi)Tg為-51℃，而胞外溶液Tg為-120℃ ^[12] 。由于細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞外溶液的Tg的懸殊差異，當(dāng)胞內(nèi)已實(shí)現(xiàn)玻璃化化時(shí)，胞外溶液尚未達(dá)到Tg。胞內(nèi)納米孔隙內(nèi)與胞外的溶液中，小分子溶質(zhì)還保持一定程度的流動(dòng)性，在胞外區(qū)室和細(xì)胞膜之間依然存在生物活性反應(yīng)。只有體系整體溫度低于胞外溶液Tg時(shí)，局部的這類小分子活動(dòng)才會(huì)完全停止。因此，要確保體系長(zhǎng)期穩(wěn)定儲(chǔ)存，最終保存溫度必須低于細(xì)胞外介質(zhì)Tg。含冷凍保護(hù)劑DMSO的胞外保存液Tg通常介于-120℃ ～ -123℃區(qū)間 ^[15] 。

       關(guān)于細(xì)胞樣品玻璃化處理所需的理論臨界冷卻速率（critical cooling rate, CCR)有107℃/min [16] 、106℃/min [6] 、100000℃/min ^[12] 以及450000℃/min ^[14] 等多種理論模型推導(dǎo)值。實(shí)際工作中，由于低溫保護(hù)劑的運(yùn)用、不同細(xì)胞類型的表面積與體積比以及細(xì)胞過(guò)程中水分流失量的差別，玻璃化轉(zhuǎn)變的實(shí)際CCR值遠(yuǎn)低于上述理論值。據(jù)報(bào)道，在運(yùn)用高濃度低溫保護(hù)劑前提下，實(shí)現(xiàn)玻璃化的CCR為10–1000℃/min ^[5] 。冰核形成溫度為-12℃，酵母菌溶液玻璃化的CCR為10～100℃/min，而人類紅細(xì)胞的CCR為1000～5000℃/min，二者相差達(dá)50～100倍之多 ^[17] 。

表1. 常見程控降溫儀產(chǎn)品降溫性能參數(shù)對(duì)照表

       就目前實(shí)驗(yàn)設(shè)備控溫性能，無(wú)論是Thermo CryoMed TSCM17SV、貝納吉CX17等液氮蒸氣制冷型程控降溫儀，還是Grant CRFT、STREX CytoSAVER等氦氣斯特林壓縮機(jī)制冷系統(tǒng)，最高制冷速率與樣品快速降溫要求難以匹配。相對(duì)而言，液氮蒸氣型降溫儀的降溫速率更接近玻璃化CCR要求。

       考慮到液氮溫度低于液氮蒸氣，且液氮的熱力學(xué)傳導(dǎo)效率高于液氮蒸氣，故采用液氮降溫，就成為現(xiàn)實(shí)條件下更經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便和可行的快速降溫手段。另外，通過(guò)合理運(yùn)用冷凍保護(hù)劑，既降低樣品體系的Tm、Tg，又升高了Tg，極大縮窄樣品Tm-Th-Tg溫區(qū)跨度，通過(guò)將組織細(xì)胞樣品直接浸入液氮(?196℃)實(shí)現(xiàn)樣品玻璃化處理更合理和簡(jiǎn)便 ^[18] 。

       玻璃化轉(zhuǎn)化技術(shù)與常規(guī)慢速冷卻保存法的總體操作流程相同，關(guān)鍵區(qū)別在于深低溫轉(zhuǎn)移前樣品冷卻降溫方式的不同。

表2. 玻璃化冷凍保存法 VS 常規(guī)緩慢冷凍法操作流程 ^[18]

       表2所引案例，將“② 樣品降溫冷卻”與“③ 深低溫儲(chǔ)存”合并，將經(jīng)2不脫水平衡后細(xì)胞樣品管直接浸入液氮完成玻璃化處理和并保存。而更多報(bào)告中都保留“②樣品降溫冷卻”，將脫水平衡后的組織細(xì)胞樣品管浸入液氮執(zhí)行短時(shí)快速降溫以促使玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變 ^{[9, 11, 19]} ，隨后再轉(zhuǎn)移至Thermo CryoExtra 40、貝納吉YDD-460-320P這類高效液氮?dú)庀鄡?chǔ)存罐或-150℃深低溫冰箱中進(jìn)行長(zhǎng)期儲(chǔ)存存 ^{[11, 20]} 。

4、生物樣本玻璃化保存技術(shù)所面臨的挑戰(zhàn)

       倫敦大學(xué)學(xué)院進(jìn)化生物化學(xué)教授、2016年皇家學(xué)會(huì)邁克爾?法拉第獎(jiǎng)獲得者尼克?萊恩(Nick Lane)指出，冷凍保存技術(shù)堪稱科學(xué)界最棘手的難題之一。馬祖爾也指出，單純基于生物物理學(xué)原理建立的方法無(wú)法從根本上解決現(xiàn)存冷凍保存的技術(shù)難題。

       盡管科研界層投入大量精力研究細(xì)胞冷凍保存技術(shù)，但迄今為止，并非所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞都能實(shí)現(xiàn)“同等”有效地保存。直接沿用傳統(tǒng)細(xì)胞冷凍儲(chǔ)存方法進(jìn)行未完全分化的天然或工程化哺乳動(dòng)物細(xì)胞的保存時(shí)，往往難有成效。即便是“成功保存”的細(xì)胞系，雖細(xì)胞外形和結(jié)構(gòu)并無(wú)異常征象，但在解凍后24-48小時(shí)內(nèi)常出現(xiàn)30%-70%的死亡率 ^[6] 。

       細(xì)胞復(fù)蘇后延遲性死亡的原因有多種，譬如：玻璃化細(xì)胞解凍復(fù)溫過(guò)程高濃度冷凍保護(hù)劑暴露期間的細(xì)胞毒性，臨界升溫速率（Critical warming rate, CWR）過(guò)低所致結(jié)冰、再結(jié)晶和樣品開裂造成的細(xì)胞損壞等。無(wú)論是高濃度冷凍保護(hù)劑毒性侵害、冰晶再生成或玻璃化體系內(nèi)部開裂，固然可通過(guò)提高解凍復(fù)溫速度縮短危害暴露時(shí)間來(lái)解決。但復(fù)蘇期過(guò)程規(guī)避細(xì)胞受損風(fēng)險(xiǎn)所需CWR通常比實(shí)現(xiàn)玻璃化狀態(tài)所需的CCR高一到兩個(gè)數(shù)量級(jí)。以酵母為例，40000℃/min的 CWR方案，復(fù)蘇后存活細(xì)胞數(shù)量要比1℃/min CWR方案獲得的活細(xì)胞數(shù)高出7個(gè)數(shù)量級(jí) ^[5] 。如此高的CWR，絕非依托普通37℃恒溫水浴所能實(shí)現(xiàn)。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室而言，高CWR技術(shù)路線落地施行難度不小。

       在一個(gè)保存周期內(nèi)，細(xì)胞通常須兩次穿越-15℃～-60℃的中間溫度區(qū)間：一次是冷卻階段，另一次是解凍階段。體系溫度高于Tg，胞外溶液有冰晶存在時(shí)，胞質(zhì)可能因胞外冰晶穿透質(zhì)膜而誘發(fā)異相成核，故細(xì)胞的冰晶成核典型溫度覆蓋范圍極為寬泛（從-5℃～-30℃甚至更低溫度），胞內(nèi)冰晶暴露風(fēng)險(xiǎn)高、時(shí)間窗口長(zhǎng) ^[17] 。造成了常見的樣品解凍去玻璃化過(guò)程中的冰晶成核及重結(jié)晶現(xiàn)象 ^[13] 。此外，脫水細(xì)胞在解凍過(guò)程中長(zhǎng)時(shí)間若暴露于胞外低滲緩沖液中，水分通過(guò)細(xì)胞膜大量涌入，引發(fā)細(xì)胞變形甚至裂解。

       除了CWR，玻璃化樣品復(fù)溫成功的另一個(gè)要素，是樣品體系內(nèi)部的均勻升溫。樣品內(nèi)部升溫不均衡，則出現(xiàn)溫度、導(dǎo)熱系數(shù)、膨脹系數(shù)差異化區(qū)帶，區(qū)帶間的組織應(yīng)力往往引發(fā)固化樣品裂紋或斷裂。因此，對(duì)于玻璃化的大型生物樣本、組織和器官?gòu)?fù)溫過(guò)程，有效的CWR方案以避免斷裂產(chǎn)生仍是一項(xiàng)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn) ^[21] 。

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