水是生命之源，因?yàn)榈厍蛏纤猩^(guò)程都是在水環(huán)境中發(fā)生的。水是生物賴以生存的最有價(jià)值的物質(zhì)資源。動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)量的70-85%都是水，其中，胞質(zhì)部分水含量占細(xì)胞水總質(zhì)量的50-60%，細(xì)胞器中的水占比20-30%，細(xì)胞核中所含水份占比最低，為10-15%。20世紀(jì)70年代以來(lái)，隨著電解質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子對(duì)水理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)狀態(tài)的影響，水分子在生物大分子三維結(jié)構(gòu)中的定位以及水分子對(duì)大分子構(gòu)象與生物功能維持中的作用，細(xì)胞內(nèi)部區(qū)室對(duì)對(duì)水分子的運(yùn)動(dòng)、擴(kuò)散阻擋效應(yīng)，水在膜結(jié)構(gòu)中的定位和功能等重要問(wèn)題研究的開展，為水與細(xì)胞酶激活、能量代謝、生長(zhǎng)繁殖和膜功能活動(dòng)等的關(guān)聯(lián)提供了新的見解。

       水與細(xì)胞體系間相互作用的多樣化，歸根到底，與水的微觀結(jié)構(gòu)復(fù)雜性有關(guān)。特別是，當(dāng)我們想探索和改進(jìn)細(xì)胞低溫冷凍保存技術(shù)方法的時(shí)候，液態(tài)水的微觀結(jié)構(gòu)的特殊性和對(duì)誰(shuí)理化性質(zhì)的影響，就不得不察。

一、水微觀結(jié)構(gòu)的基本概念

       2005年,《Science》雜志將水的結(jié)構(gòu)列為人類所面臨的125個(gè)難題之一。2016年，學(xué)者卡特琳·阿曼-溫克爾（Katrin Amann-Winkel）在《Reviews of Modern Physics》撰寫的“水的有爭(zhēng)議的玻璃過(guò)渡”一文所說(shuō)的那樣：人們對(duì)水研究最多卻依然知之甚少；研究投入精力越多、研究手段越先進(jìn)，對(duì)水認(rèn)知卻越感迷茫。

       關(guān)于液態(tài)水微觀結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)，很早就建立有分離模型(也稱混合模型)和連續(xù)模型兩種對(duì)立的理論 ^[1] 。但直到1960年，Pauling在《化學(xué)鍵的本質(zhì)》中提出氫鍵的概念后，對(duì)液態(tài)水的微觀結(jié)構(gòu)研究才逐步走向深入。

       水分子由1個(gè)氧原子和2個(gè)氫原子通過(guò)極性共價(jià)鍵結(jié)合而成的。由于H、O原子間共用電子對(duì)強(qiáng)烈偏向O原子，導(dǎo)致水分子的極性特性，共價(jià)鍵內(nèi)電子云分布不均衡：H原子帶正電而O原子帶負(fù)電。O原子會(huì)與相鄰水分子中的H原子產(chǎn)生相互吸引作用形成“氫鍵”（hydrogen bonding） ^[2] 。氫鍵的鍵長(zhǎng)與鍵角可因環(huán)境而變。氫鍵是水的微觀結(jié)構(gòu)中最重要的相互作用力之一,但氫鍵作用弱。常溫下，水分子處于劇烈的熱運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，并可自由旋轉(zhuǎn)。因此，水分子間相對(duì)運(yùn)動(dòng)，使脆弱的氫鍵不斷的運(yùn)動(dòng)和重組，整個(gè)氫鍵網(wǎng)絡(luò)存在高度不穩(wěn)定性和動(dòng)態(tài)調(diào)整 ^[1] 。

       按分離模型理論, 水分子通過(guò)氫鍵形成含水分子數(shù)目不一的小水分子簇（water molecule clusters）。這些水分子簇見相互分離,不同簇有著不同的氫鍵結(jié)構(gòu)。而液態(tài)水則是一系列包含多種構(gòu)型水分子簇的混合物 [1] 。理論上，液態(tài)水中，一個(gè)水分子最多可與周圍相鄰的4個(gè)水分子通過(guò)氫鍵連接成一個(gè)正四面體晶體結(jié)構(gòu)（如圖1，1個(gè)核心水分子位于中心，4個(gè)頂點(diǎn)為4個(gè)水分子的O原子）。四面體的外圍四個(gè)水分子構(gòu)成圍繞中心水分子的第一個(gè)水分子殼層。因水分子的位置不固定，四面體結(jié)構(gòu)處于解體和重構(gòu)的動(dòng)態(tài)變換中。

       實(shí)際上，一個(gè)水分子與周圍水分子形成的氫鍵結(jié)構(gòu)是動(dòng)態(tài)變化的。Saykally觀察到每個(gè)水分子平均形成3.3個(gè)氫鍵現(xiàn)象，證實(shí)液態(tài)水的主要微觀構(gòu)型是四面體結(jié)構(gòu)。Nilsson提出，單個(gè)水分子所形成的氫鍵數(shù)量、結(jié)構(gòu)與水溫有關(guān)。在25℃～90℃范圍內(nèi), 大部分水分子結(jié)合最緊密的外圍分子數(shù)不是四面體結(jié)構(gòu)那樣4個(gè), 而是2-3個(gè)，其中兩個(gè)是強(qiáng)氫鍵，一個(gè)是弱氫鍵。因此，液態(tài)水內(nèi)部的微觀結(jié)構(gòu)并非只有單一正四面體結(jié)構(gòu)一種，還存在“繩圈”構(gòu)象模型(ring conformation)。這兩種構(gòu)型水分子簇可以相互轉(zhuǎn)換，各自的組成比例受溫度影響而波動(dòng)。水溫降低時(shí)，四面體構(gòu)型的比例會(huì)升高 ^{[1, 3]} 。常溫下，繩圈構(gòu)型對(duì)水理化性質(zhì)的影響比四面體構(gòu)型更重要。在過(guò)冷水中，繩圈構(gòu)型會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)樗拿骟w構(gòu)型 ^[4] 。因此，水溫越低，水分子數(shù)量更多、氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更復(fù)雜的水分子簇組成比例越高。

       即便是四面體結(jié)構(gòu)，也可以細(xì)分出低密度（L）、高密度（H）和超高密度結(jié)構(gòu)（U）至少三種不同亞型 ^[5] 。L構(gòu)型的中心水分子與第一殼層水分子形成對(duì)稱的四面體空間結(jié)構(gòu)，距離相對(duì)較遠(yuǎn)的鄰近水分子則處在第二水分子殼層上，兩個(gè)殼層的間隙大，故分子質(zhì)量密度較低；H構(gòu)型的中心水分子與第一殼層水分子形成的結(jié)構(gòu)中，氫鍵扭曲，四面體結(jié)構(gòu)存在坍塌，造成第二殼層水分子進(jìn)入到第一二殼層之間的間隙中，兩個(gè)水分子殼層的間隙壓縮，故分子質(zhì)量密度升高。在液態(tài)水中，這L、H兩種構(gòu)型水分子簇的比例會(huì)因溫度改變。溫度升高時(shí)，H構(gòu)型成分增加而L構(gòu)型成分減少 ^[6] 。水的各種奇異性質(zhì)，據(jù)說(shuō)可能與這兩種成份間的轉(zhuǎn)化有關(guān)。U構(gòu)型為超高密度（五氫鍵）水分子簇結(jié)構(gòu)，水分子能與鄰近的五個(gè)水分子形成氫鍵。U型水分子簇并并凝聚在一起，而是分散在H構(gòu)型水分子簇群中。在常溫常壓下，U型水分子簇的組成比例約占7%，隨溫度上升則占比增加。

       水的微觀結(jié)構(gòu)涉及水分子氫鍵的形成、水分子排列及不同狀態(tài)下的動(dòng)態(tài)變構(gòu)，會(huì)對(duì)水理化性質(zhì)有重要影響。水環(huán)境的溫度變化、鹽度改變、PH值波動(dòng)等條件不同，可能導(dǎo)致水分子簇的構(gòu)型、氫鍵數(shù)量存在差異。而不同類型水分子簇與細(xì)胞內(nèi)生物大分子、極性分子、帶電粒子的水合物的結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性因此而存在差別，包繞在生物大分子和荷電粒子表面的水分子殼層厚薄不同，使得細(xì)胞內(nèi)自由水的重新分布，可能會(huì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)外生理環(huán)境產(chǎn)生影響。

       與分離模型相對(duì)，在連續(xù)模型中，所有水分子都被納入一個(gè)統(tǒng)一的氫鍵網(wǎng)格，其能量和幾何參數(shù)是連續(xù)分布的。水分子形成的準(zhǔn)晶格會(huì)因熱、靜電和其他作用而變形，而氫鍵也因此經(jīng)受拉力和彎曲，造成氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變化。這種不穩(wěn)定的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，使水的微觀結(jié)構(gòu)具有高度隨機(jī)性和復(fù)雜性 ^[3,7] 。當(dāng)有新的物質(zhì)溶入水中，將不同程度地改變氫鍵網(wǎng)絡(luò)。譬如，添加鹽會(huì)讓氫鍵更緊密，而乙醇溶入會(huì)讓氫鍵網(wǎng)絡(luò)變松散。

       水分子中氫鍵網(wǎng)絡(luò)由于處于不斷地?cái)嗔雅c重構(gòu)的動(dòng)態(tài)過(guò)程中，使得水中的氫鍵并不僅僅局限于水分子之間產(chǎn)生，水分子還可與蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖聚合物、核酸等生物大分子以及乙二醇（ethylene glycol, EG）、二甲基亞砜（(Dimethyl sulfoxide, DMSO)等許多水溶性化合物分子間發(fā)生氫鍵。而這正是我們要從液態(tài)水的微觀結(jié)構(gòu)出發(fā)來(lái)重新認(rèn)識(shí)和審視組織細(xì)胞低溫冷凍保存技術(shù)的原理與方法的原因。 

二、從水分子到細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成歷程

       氫鍵作用強(qiáng)度比共價(jià)鍵弱，與水分子之間的有序排列與無(wú)序熱運(yùn)動(dòng)之間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。水溫高于4℃時(shí)，水分子熱運(yùn)動(dòng)較劇烈。受水分子間無(wú)序碰撞影響，氫鍵生成后會(huì)迅速斷裂，難以產(chǎn)生大量結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的締合水分子簇。當(dāng)水溫低至0℃以下時(shí)，水分子熱運(yùn)動(dòng)動(dòng)能降低，氫鍵的鍵合作用超過(guò)了水分子熱運(yùn)動(dòng)沖擊效果，則越來(lái)越多的水分子通過(guò)氫鍵結(jié)合并形成分子規(guī)則排列的四面體結(jié)構(gòu)。溫度越低，水分子間越容易形成四面體。游離的水分子所形成各種不同空間構(gòu)象水分子簇的組成比例與結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致液態(tài)水的水的粘度、焓和表面張力改變，進(jìn)而又影響水過(guò)冷和冰晶形成。

       冰作為水的一種凝聚態(tài)形式，有超過(guò)20種不同的晶相和非晶結(jié)構(gòu)形式。其中有19種為晶體結(jié)構(gòu)，但只有六方相冰Ih和立方相冰Ic可在自然界中自發(fā)形成和存在。其中冰Ih在自然界中最為常見,如冬日的雪花、南極冰川等固體冰，都是Ih晶體相。而Ic結(jié)構(gòu)冰晶只存在于很低溫度環(huán)境下。Ih中的羅馬字母I代表它們是人類所發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)晶體相, 字母h代表其六角形(Hexagonal)規(guī)則排列的結(jié)構(gòu)。Ih中的氧原子規(guī)則地排列在六角形晶格上，Ih內(nèi)每個(gè)水分子可與最近鄰的水分子形成4個(gè)氫鍵, 并且每個(gè)氧原子與4個(gè)相鄰氧原子形成一個(gè)四面體空間構(gòu)型 ^[8] 。

       目前認(rèn)為，冷凍保存復(fù)蘇過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)大量冰晶的形成以及由此所導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的損傷，是復(fù)蘇后細(xì)胞死亡的重要原因 ^[9] 。

       溶液結(jié)晶是一種結(jié)晶性材料制備方法，其過(guò)程始于三維晶核的形成，即成核。隨后通過(guò)晶核線簇的多面化以及二維晶面介導(dǎo)的生長(zhǎng)過(guò)程，晶核方可形成宏觀可見的晶體。但目前關(guān)于晶體的成核機(jī)理仍然不清晰。最早的晶體成核理論為經(jīng)典成核理論(classical nucleation theory)。該理論認(rèn)為晶體的成核與生長(zhǎng)過(guò)程是通過(guò)原子、離子或分子等單體在逐步附著和脫附動(dòng)態(tài)平衡中實(shí)現(xiàn)的，同時(shí)伴隨著密度和結(jié)構(gòu)的變動(dòng)。溶液線簇的堆積結(jié)構(gòu)有序、線性而均勻。而越來(lái)越多的研究表明，許多晶體在成核前會(huì)產(chǎn)生尺寸小于60 nm的溶液前聚體，通常以無(wú)序團(tuán)簇、聚集體團(tuán)簇、納米粒子、低聚物等形式存在，這些結(jié)構(gòu)往往是無(wú)序的、非線性的、不均勻的。經(jīng)典成核理論中的溶液線簇結(jié)構(gòu)及其行為的描述方法在含有溶液前聚體的物系中并不適用。為了解決這一問(wèn)題，二步成核理論(two-step nucleation theory)、預(yù)成核團(tuán)簇理論(pre-nucleation clusters theory)、粒子附著晶化理論(crystallization by particle attachment theory)等具有代表性的非經(jīng)典成核理論相繼被提出，仍有待完善。

       無(wú)論是經(jīng)典或非經(jīng)典晶體成核理論，水溶液結(jié)冰過(guò)程，始發(fā)逾水分子單體相互碰撞后生成水分子簇，小水分子簇之間進(jìn)一步聚集后形成晶核。晶核在有足夠的游離水分子存在和適度溫度條件下，體積增長(zhǎng)達(dá)到臨界體積后轉(zhuǎn)變成臨界晶核。而大量水分子按Ih冰晶體結(jié)構(gòu)要求有序結(jié)合到晶核上，晶核成長(zhǎng)為宏觀尺寸的晶體 ^[10] ，液體才會(huì)開始凍結(jié)。反之，任何尺寸小于臨界成核尺寸的晶核，將自發(fā)縮小消亡而不會(huì)形成冰晶。

       水溫度低于0℃冰點(diǎn)后，不會(huì)立即發(fā)生液固態(tài)轉(zhuǎn)變，而是處于“過(guò)冷”(supercool)的狀態(tài)。溶液過(guò)冷度用于描述溶液溫度與平衡熔化溫度（equilibrium melting temperature, Tm）值的偏差程度。溫度越低，偏離Tm值越多，則溶液過(guò)冷度越高，成核臨界尺寸越小，液體自發(fā)形成的晶核概率越大?？梢姡芤航Y(jié)冰凝固一是要溫低于過(guò)冷度臨界溫度，二是晶核大小達(dá)到成核臨界尺度。一般認(rèn)為，溶液結(jié)晶的起始溫度介于Tm和均相成核溫度（homogeneous nucleation temperature, Th）之間。

       過(guò)冷狀態(tài)的水分子呈現(xiàn)三種形態(tài)，即自由水分子，締合水分子和四面體晶體結(jié)構(gòu)。在晶核未達(dá)到臨界尺寸前，這種趨勢(shì)就會(huì)持續(xù)存在。但一旦條件有利，就會(huì)聚集成更大的晶核并在溶液中高速傳播。當(dāng)溫度低于Th時(shí)，均相水溶液最終會(huì)自發(fā)均勻成核而凝固 ^[11] 。純水勻相成核溫度，一般認(rèn)為是-41℃（272K）。

       計(jì)算模型顯示，生成穩(wěn)定晶核的機(jī)率與樣品體積相關(guān)。溶液體積越大，自由水越多，越有利于晶核成長(zhǎng) ^[12] 。反之，限制自由水分子的體積和水分子的擴(kuò)散與聚集，將造成晶核發(fā)育過(guò)程受損，可有效阻遏液體冰晶的形成。

參考文獻(xiàn)

[1]  林珂, 劉世林, 羅毅. 水的局域結(jié)構(gòu)和譜學(xué)特征. 中國(guó)科學(xué): 物理學(xué)力學(xué) 天文學(xué), 2016, 46: 057003.

[2]  Ouyang Zheng, Li Zhang, Qinxiu Sun, Shucheng Liu. Basic Theory of Ice Crystallization Based on Water Molecular Structure and Ice Structure. Foods. 2024 Aug 30;13(17):2773. doi: 10.3390/foods13172773.

[3]  鄧耿, 尉志武. 液態(tài)水的結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展. 科學(xué)通報(bào)，2016，61(30): 3181-3187

[4]  秦曉玲，朱栩量，曹靖雯，王浩誠(chéng)，張鵬.冰的氫鍵振動(dòng)研究.物理學(xué)報(bào)，2021；70(14)：146301.

[5]  Cheng Yang, Chuanbiao Zhang, Fangfu Ye, Xin Zhou. Ultra-high-density local structure in liquid water. Chin. Phys. B . 2019, 28(11): 116104.

[6]  楊成 周昕.液態(tài)水中的多種局域結(jié)構(gòu).物理學(xué)報(bào). 2016,65(17):176501.

[7]  曹則賢. 熟悉而又難以理解的水.物理，2016，45（11):701-706.

[8]  孫兆茹, 潘鼎, 徐莉梅, 等. 冰表面結(jié)構(gòu)及其物理特性的新探索. 中國(guó)科學(xué): 物理學(xué) 力學(xué) 天文學(xué), 2013, 43: 1144–1150.

[9]  Vasco Sampaio‐Pinto, Jasmijn Janssen, Nino Chirico, et al. A Roadmap to Cardiac Tissue‐Engineered Construct Preservation: Insights from Cells, Tissues, and Organs. Adv Mater. 2021 Jul 8; 33(27): 2008517.

[10]  汪帆,劉巖博,李康麗，等.溶液結(jié)晶中的介尺度成核過(guò)程研究進(jìn)展.化工學(xué)報(bào),2022,(6):2318-2333.

[11]  Pierre Vanderzwalmen, Fabien Ectors, Yannis Panagiotidis, et al. The Evolution of the Cryopreservation Techniques in Reproductive Medicine —— Exploring the Character of the Vitrified State Intra- and Extracellularly to Better Understand Cell Survival after Cryopreservation. Reprod. Med. 2020, 1(2), 142-157.

[12]  Karlsson JO, Cravalho EG, Borel Rinkes IH, et al. Nucleation and growth of ice crystals inside cultured hepatocytes during freezing in the presence of dimethyl sulfoxide. Biophys J. 1993 Dec;65(6):2524–36.