根據(jù)國(guó)際生物與環(huán)境儲(chǔ)存庫(kù)學(xué)會(huì)（International Society for Biological and Environmental Repositories, ISBER）2012年頒布的《研究用生物材料收集、存儲(chǔ)、檢索和分發(fā)存儲(chǔ)庫(kù)最佳實(shí)踐》指南 ^[1] ，-132℃，即水的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，是所有生物活性反應(yīng)停止之臨界溫度 ^[2] 。

       在?132℃到?196℃的深低溫環(huán)境中，生物樣本材料中的動(dòng)能和分子運(yùn)動(dòng)顯著降低，新陳代謝、主動(dòng)運(yùn)輸、酶促反應(yīng)及擴(kuò)散等過(guò)程均極大減弱甚至完全停滯 ^[3] ，避免細(xì)胞因長(zhǎng)期培養(yǎng)導(dǎo)致的表型漂移（phenotypic drift），可最大程度保持冷凍前的功能狀態(tài)和結(jié)構(gòu)的完整性。報(bào)道顯示，在液氮中保存了28年的人類精子依然保持著與卵母細(xì)胞透明帶的正常結(jié)合能力 ^[4] 。人體心臟主動(dòng)脈瓣在液氮中儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)10年后，依然保持成纖維細(xì)胞表型、結(jié)構(gòu)保存完好 ^[5] 。因此，低溫保存方法在再生醫(yī)學(xué)、輔助生殖治療(assisted reproduction technology, ART)、生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究、畜牧繁殖、生物多樣性保護(hù)與瀕危物種保育和生物種質(zhì)資源保存領(lǐng)域的都具有關(guān)鍵應(yīng)用價(jià)值 ^[6] 。

       近年來(lái)，人類胚胎干細(xì)胞（human embryonic cell, hES）、類器官等干細(xì)胞衍生制品在臨床治療、基礎(chǔ)科學(xué)研究及體外藥理毒性篩選中的潛在應(yīng)用引起廣泛關(guān)注。過(guò)去數(shù)十年來(lái)所采用的各種低溫冷凍保存方法，對(duì)于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的保存較為理想，但用于干細(xì)胞、組織（如皮膚、血管和軟骨）和生殖器官等組織類型的儲(chǔ)存時(shí)，還面臨回收率低、組織斷裂受損等多重挑戰(zhàn)。據(jù)報(bào)道，用傳統(tǒng)冷凍保存方案復(fù)蘇后，干細(xì)胞的損失占比可高達(dá)60-70% ^[7] 。以常規(guī)體細(xì)胞和鼠類胚胎干細(xì)胞凍存方法保存的hES細(xì)胞，存活率只有5%左右 ^[8] 。因此，有效的hES及衍生品冷凍保存方案匱乏，被認(rèn)為是制約新型細(xì)胞技術(shù)研究應(yīng)用的瓶頸。

       生物樣本中的降溫過(guò)程中，胞內(nèi)冰晶形成與生長(zhǎng)與復(fù)蘇升溫階段再結(jié)晶所產(chǎn)生的機(jī)械損傷與溶液滲透壓失衡、冷凍保護(hù)劑的細(xì)胞毒性、儲(chǔ)存溫度波動(dòng)等因素，造成了細(xì)胞損傷、低恢復(fù)率。此外，傳統(tǒng)玻璃化技術(shù)可處理組織體積與通量偏小，還無(wú)法有效滿足科研臨床實(shí)際應(yīng)用要求。根據(jù)人體干細(xì)胞、組織類器官材料的特性，探索可最大限度降低細(xì)胞損失、維持細(xì)胞功能活性和應(yīng)用要求的組織細(xì)胞保存方法，是當(dāng)前溫生物學(xué)領(lǐng)域所面臨的主要挑戰(zhàn)。近年來(lái)，組織細(xì)胞低溫保存技術(shù)方法研究重新引發(fā)學(xué)界的關(guān)注，對(duì)新型細(xì)胞低溫防護(hù)材料、快速冷卻降溫方法和超快解凍復(fù)溫技術(shù)開發(fā)應(yīng)用有升溫趨勢(shì)，在工程技術(shù)上已取得階段性重要突破 ^[9-11]

       基于多數(shù)人對(duì)于冷凍保存相關(guān)的細(xì)胞死亡、常用細(xì)胞低溫冷凍保護(hù)劑作用的理解，本文從水分子與細(xì)胞密切相互作用角度，對(duì)低溫保存過(guò)程中細(xì)胞損傷的可能誘因和未來(lái)新型細(xì)胞冷凍保存試劑開發(fā)策略作了討論。                                              

一、對(duì)冷凍保存過(guò)程中細(xì)胞死亡現(xiàn)象的認(rèn)識(shí)過(guò)程

1.1 經(jīng)典細(xì)胞死亡冰晶說(shuō)

       巴西爾·盧耶特（Basile J. Luyet）是1964年在美國(guó)成立的國(guó)際低溫生物學(xué)會(huì)（Society for Cryobiology）成立時(shí)的首任會(huì)長(zhǎng) ^[12] 。他1927年在瑞士日內(nèi)瓦大學(xué)獲得物理學(xué)博士學(xué)位后留校任教，1929年前往美國(guó)耶魯大學(xué)從事生物學(xué)博士后研究。1931年始在美國(guó)圣路易斯大學(xué)擔(dān)任生物學(xué)副教授，正式開啟了低溫生物學(xué)的研究生涯。1934年，創(chuàng)辦學(xué)術(shù)期刊《Biodynamica》時(shí)，盧耶特身兼編輯、出版人，同時(shí)也是主要撰稿人之一 ^[13] 。自然科學(xué)和物理學(xué)研學(xué)經(jīng)歷、德國(guó)物理化學(xué)家塔曼（G. Tammann）的結(jié)晶動(dòng)力學(xué)原理理論，使盧耶特養(yǎng)成用物理定律來(lái)定義生物學(xué)中物質(zhì)狀態(tài)的思維習(xí)慣。正是他，將物理化學(xué)與生物學(xué)結(jié)合而推動(dòng)了一個(gè)新的科學(xué)分支——冷凍生物學(xué)的誕生。

       盧耶特在“The Vitrification of Organic Colloids and of Protoplasm”（有機(jī)膠體與原生質(zhì)的玻璃化）一文中提出了低溫生物學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)基礎(chǔ)理論：細(xì)胞內(nèi)對(duì)冰核和冰晶形成的控制，是決定所有冷凍保存細(xì)胞活性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。胞內(nèi)液態(tài)水轉(zhuǎn)化為冰晶的聚集狀態(tài)變化，是細(xì)胞死亡的首要誘因。為抑制結(jié)晶過(guò)程，呂耶特提出了“玻璃化(Vitrification)”的概念原理，目的是將液態(tài)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無(wú)晶體結(jié)構(gòu)的與玻璃屬性類似的非晶態(tài)固體 ^[14] 。

       1938年，盧耶特和Hodapp報(bào)告了第一個(gè)玻璃化冷凍保存精子的成功案例。1940年，盧耶特與Pierre M. Gehenio修女在“Life and death at low temperatures”（低溫下的生與死）著述中對(duì)玻璃化的基本原理做了闡釋：“使物質(zhì)玻璃化的唯一方法是將其置于液態(tài)或氣態(tài)并迅速冷卻，以便在比材料凍結(jié)所需的時(shí)間更短的時(shí)間內(nèi)跳過(guò)結(jié)晶溫度區(qū)域”。而“為避免凍結(jié)，物體溫度應(yīng)以每秒數(shù)百攝氏度的速度下降” ^[15] 。晶核一旦形成，晶體的生長(zhǎng)速度會(huì)進(jìn)一步加快。若要避免結(jié)晶，物質(zhì)必須快速度降溫越過(guò)溶液結(jié)冰溫度區(qū)。當(dāng)溫度到達(dá)玻璃化轉(zhuǎn)變溫度以下時(shí)，溶液就已轉(zhuǎn)變成非晶態(tài)固體，水分子熱運(yùn)動(dòng)被嚴(yán)格約束，相互間無(wú)法聚集而保持著無(wú)序分布狀態(tài)。玻璃化技術(shù)思想建立的年代，甘油對(duì)低溫生物組織儲(chǔ)存的作用尚未被發(fā)現(xiàn)，受限于當(dāng)時(shí)璃化冷凍降溫技術(shù)的限制，玻璃化保存方法遲遲難以落地推廣實(shí)施。

       格雷戈里?M?法伊(Gregory M. Fahy)為美國(guó)紅十字會(huì)的應(yīng)用冷凍生物學(xué)家。他繼承了盧耶特的玻璃化思想，提出通過(guò)玻璃化冷凍技術(shù)器官保存的技術(shù)構(gòu)想，并在1985年的小鼠胚胎玻璃化保存獲得成功小鼠胚胎冷凍玻璃化保存技術(shù) ^[16] 。得益于甘油和二甲基亞砜(DMSO)等細(xì)胞低溫冷凍保護(hù)劑在生物組織材料保存的普遍應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)，法伊以較低的冷卻速率實(shí)現(xiàn)樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變，將原本小體積樣品適用的處理技術(shù)拓展用于大型組織和器官冷凍的保存，玻璃化冷凍保存技術(shù)理念實(shí)用化獲得成功 ^[7] 。1990年代的中期后，玻璃化冷凍輔助生殖技術(shù)成功案例涌現(xiàn)，充分證明玻璃化保存方法的冷凍損傷風(fēng)險(xiǎn)低、細(xì)胞存活率高優(yōu)勢(shì) ^[17] ，得到學(xué)界普遍關(guān)注和認(rèn)可。

       彼得?馬祖爾(Peter Mazur, 1928-2015)是低溫生物學(xué)界的另一位泰斗，曾于1973-1974年擔(dān)任美國(guó)冷凍生物學(xué)會(huì)會(huì)長(zhǎng)。他發(fā)表的170多篇學(xué)術(shù)論文中，有4篇為科學(xué)界奉為“引用經(jīng)典”（Citation Classics）論文。馬祖爾創(chuàng)立了冷凍保存領(lǐng)域著名的“冷凍損傷的雙因素假說(shuō)”（Two-Factor Hypothesis of Freezing Injury）。

       1963年在“Kinetics of Water Loss from Cells at Subzero Temperatures and the Likelihood of Intracellular Freezing”一文中，馬祖爾指出，細(xì)胞緩慢冷卻降溫可提高細(xì)胞存活率的思想。在“The Role of Cell Membranes In the Freezing of Yeast and Other Single Cells”中，他深入探討了酵母及其他簡(jiǎn)單細(xì)胞的細(xì)胞膜特性如何影響冷凍過(guò)程中的細(xì)胞存活或死亡概率。1970年，通過(guò)對(duì)比不同冷卻速率對(duì)細(xì)胞存活率的影響后，他指出，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞最高存活率所需的冷卻速率因細(xì)胞類型而異，而且與冷凍溶液中的鹽濃度密切相關(guān) ^[18] 。1972年，馬祖爾與合作者在“A Two-Factor Hypothesis of Freezing Injury: Evidence from Chinese Hamster Tissue-culture Cells” ^[19]一文中正式提出了“冷凍損傷的雙因素假說(shuō)”的術(shù)語(yǔ)。在對(duì)這一術(shù)語(yǔ)解釋過(guò)程中，旗幟鮮明地提出了細(xì)胞冷凍保存中的中等冷卻速率（intermediate rates of cooling）、快速解凍復(fù)溫的指導(dǎo)原則。由此衍生的中等速率冷凍+快速?gòu)?fù)溫解凍方法，正是現(xiàn)在稱為“緩慢冷凍保存法”原理之精髓。

       概況起來(lái)，冷凍損傷雙因素假說(shuō)的內(nèi)涵主要有以下幾點(diǎn) ^[20] 。

1）冷凍過(guò)程中細(xì)胞損傷由鹽濃度和冰晶兩種因素共同決定

       高鹽濃度損害與緩慢降溫方式相關(guān)，而冰晶損害發(fā)生于快速冷卻模式。細(xì)胞溶液冷卻時(shí)，溫度下降到溶液的冰成核溫度后，胞外水會(huì)與溶解鹽分離而首先結(jié)冰。隨著冰晶形成，未凍結(jié)溶液中的鹽濃度逐漸升高，造成了胞膜內(nèi)外鹽濃度的差，進(jìn)而推動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的水分子通過(guò)滲透作用向高鹽區(qū)域遷移，以維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡。細(xì)胞內(nèi)外水分的流動(dòng)速度取決于降溫速率?？焖俳禍啬芸s短細(xì)胞的高鹽暴露時(shí)間，但同時(shí)也縮短了細(xì)胞內(nèi)水分滲出時(shí)間，大量殘留水分最終會(huì)在細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰。胞內(nèi)冰晶的形成會(huì)擾亂細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)，具有破壞性且可能致其完全喪失功能。而減緩降溫速率時(shí)，水向外滲出時(shí)間充足，胞內(nèi)殘留水份更少，冰晶生成減少。但同時(shí)，長(zhǎng)時(shí)間高鹽溶液暴露會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞受損。

2）細(xì)胞解凍復(fù)溫速率快慢影響胞內(nèi)冰晶再結(jié)晶程度

       過(guò)冷環(huán)境下升溫時(shí)，胞內(nèi)有再次形成冰晶的時(shí)間窗口。緩慢升溫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)部、胞外溶液從冰點(diǎn)以下上升到并平衡熔點(diǎn)過(guò)程長(zhǎng)，冰晶形成時(shí)間窗口長(zhǎng)，更有利于冰晶形成。相反，復(fù)溫速度快則冰晶形成時(shí)間窗口縮短，抑制冰晶大量生成。

       因此，對(duì)于快速冷凍處理的細(xì)胞，復(fù)溫速率過(guò)慢所導(dǎo)致冰晶再結(jié)晶( recrystallization)對(duì)細(xì)胞更具破壞性，會(huì)比緩慢冷卻后快速?gòu)?fù)溫的細(xì)胞受損更嚴(yán)重。換句話說(shuō)，細(xì)胞解凍過(guò)程的復(fù)溫速率是越高越好。根據(jù)這一原理，人們?cè)诖笮屠鋬霰４娼M織復(fù)溫中引入新型射頻超快速金屬模具加熱復(fù)溫技術(shù)（2000℃/分鐘）獲得成功 ^[11] 。

3）中等冷卻速率的確定和適用范圍

       綜合降溫冷卻及解凍復(fù)溫兩個(gè)階段鹽分、冰晶生成之間的密不可分，只有采用中等冷卻速率能保護(hù)細(xì)胞免受兩種損害因素的影響，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞保存后的最高存活率。中等冷卻速率原則不僅適用于酵母菌等，也適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞。中等冷卻速率是一個(gè)大致范圍，而非一個(gè)絕對(duì)值，因細(xì)胞類型和溶液組分不同而又差別。譬如，在含1.5M DMSO的保存液中，冷凍綿羊胚胎的冷卻速率0.3℃/min ^[21] 。而肝細(xì)胞三維球體則以0.1、0.2及0.3℃/min速率冷卻處理均表現(xiàn)出可重復(fù)的解凍后高恢復(fù)率 ^[22] 。不過(guò)，對(duì)于膜通透性較高的細(xì)胞類型（如紅細(xì)胞和精子細(xì)胞），在10℃/min或更高速率下冷卻時(shí)可達(dá)到最佳解凍后存活率，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞存活所需的冷凍脫水與毒性規(guī)避的關(guān)鍵平衡 ^[23] 。需注意，無(wú)論是馬祖爾時(shí)代抑或當(dāng)下，不少實(shí)驗(yàn)人員或許聽說(shuō)過(guò)細(xì)胞冷保存最佳冷卻速率應(yīng)為1℃/分鐘的提法。其實(shí)，這有悖于馬祖爾中等冷卻速率指導(dǎo)思想。

       無(wú)論是盧耶特的玻璃化技術(shù)，還是馬祖爾的“緩慢冷凍保存法”，目的都是為了解決低溫保存方法中細(xì)胞內(nèi)部冰晶的形成和生長(zhǎng)這一頑疾。馬祖爾指出，當(dāng)冰晶體積達(dá)到細(xì)胞內(nèi)部空間容積的16%，就會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞的死亡 ^[18] 。法伊等發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)被冰晶機(jī)械作用破壞是導(dǎo)致腎臟等哺乳動(dòng)物器官功能喪失的主要原因 ^[16] 。因此可以說(shuō)，包括盧耶特、馬祖爾、法伊在內(nèi)的整個(gè)科學(xué)界，對(duì)于細(xì)胞內(nèi)冰晶形成損傷是導(dǎo)致細(xì)胞活力喪失的主要原因的這一觀點(diǎn)，基本上已形成共識(shí)。

1.2 冷凍保存相關(guān)延遲性細(xì)胞死亡說(shuō)

       冷凍保存細(xì)胞復(fù)蘇后細(xì)胞死亡的蛛絲馬跡，見諸于大量細(xì)胞實(shí)驗(yàn)報(bào)告之中，可以說(shuō)這是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的常見現(xiàn)象。

       譬如，永生化的人T淋巴細(xì)胞系Jurkat細(xì)胞，通過(guò)程控降溫儀分別緩慢冷凍至-50℃的溶液玻璃化轉(zhuǎn)變溫度、-40℃非玻璃化溫度后，再各自轉(zhuǎn)移到液氮環(huán)境下保存。解凍后將各樣本細(xì)胞初始密度統(tǒng)一調(diào)整為7.5±10⁴個(gè)細(xì)胞/孔，培養(yǎng)24-48-72小時(shí)后進(jìn)行的存活率和代謝活性檢測(cè)。結(jié)果顯示，-50℃玻璃化處理的細(xì)胞解凍24小時(shí)后活性細(xì)胞數(shù)為8.8±10⁴個(gè)細(xì)胞/孔，72小時(shí)后活性細(xì)胞數(shù)升至13.1±10⁴個(gè)細(xì)胞/孔。-40℃非玻璃化處理樣品中，解凍24小時(shí)后活性細(xì)胞數(shù)為4.5±10⁷個(gè)細(xì)胞/孔，48小時(shí)后已活性細(xì)胞數(shù)為4.2±10⁷個(gè)細(xì)胞/孔，培養(yǎng)72小時(shí)內(nèi)未出現(xiàn)增殖現(xiàn)象。-50℃轉(zhuǎn)移的樣本在解凍后48小時(shí)和72小時(shí)的存活細(xì)胞數(shù)量、代謝活性值均顯著高于非玻璃化處理樣品 ^[24] 。結(jié)果表明，懸浮培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞因胞內(nèi)結(jié)冰損傷，存在解凍后的前24-72小時(shí)課出現(xiàn)持續(xù)地、大量細(xì)胞減損的事實(shí)。

       但有研究證明，對(duì)于融合單層細(xì)胞膜，細(xì)胞內(nèi)冰形成（intracellular ice formation, IIF)不僅是無(wú)害的，甚至一定程度上對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用。發(fā)生IIF情況下，V-79W中國(guó)倉(cāng)鼠成纖維細(xì)胞、MDCK細(xì)胞培養(yǎng)的單層貼壁細(xì)胞或融合單層解凍后細(xì)胞存活率有差異：對(duì)于單層貼壁細(xì)胞，IIF發(fā)生導(dǎo)致解凍后的細(xì)胞恢復(fù)能力有所降低，但存活率依然處于較高水平；而融合單層細(xì)胞，則完全免于IIF傷害，甚至在冷卻至-40℃時(shí)仍表現(xiàn)出高存活率。分析指出，若低溫緩慢冷卻損傷是源于冷凍與解凍過(guò)程中細(xì)胞體積的劇烈變化，那細(xì)胞內(nèi)適度的冰晶生成，將有利于消除細(xì)胞滲透壓失衡，阻止冷卻過(guò)程中水分子通過(guò)質(zhì)膜外流，反而發(fā)揮保護(hù)融合單層細(xì)胞免受緩慢冷卻過(guò)程中的IIF損傷的作用 ^[25] 。

       類似研究也顯示，IIF會(huì)對(duì)豬角膜內(nèi)皮細(xì)胞（porcine corneal endothelial cells, PCEC）的單層細(xì)胞膜造成即時(shí)胞膜損傷，但卻在解凍培養(yǎng)24小時(shí)后膜性維持完好。同樣是IIF，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell, HUVEC）的單層細(xì)胞膜卻未觀察到即時(shí)性損害，但在解凍后 24 小時(shí)的培養(yǎng)期間發(fā)生膜的延遲損傷 ^[26] 。這一方面證實(shí)HUVEC 和 PCEC細(xì)胞單層對(duì)IIF的反應(yīng)異質(zhì)性，另外也驗(yàn)證了IIF對(duì)細(xì)胞損傷效應(yīng)存在時(shí)間滯后性的現(xiàn)象。

       在采用標(biāo)準(zhǔn)冷凍保存條件下hES細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行凍融處理后顯示，解凍后清洗（5分鐘時(shí)間點(diǎn)）后，貼壁培養(yǎng)的hES細(xì)胞中98%保持活性。然而，當(dāng)hES細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)入37℃恒溫箱培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞活力會(huì)隨培養(yǎng)時(shí)間增加而下降。這種細(xì)胞群存活率的急劇下降可被轉(zhuǎn)移到4℃環(huán)境下遏制，但再次當(dāng)恢復(fù)至生理溫度37℃時(shí)，細(xì)胞存活率再次呈時(shí)間依賴性下降。分析指出，如果hES在冷凍保存期間的死亡是IIF和滲透休克導(dǎo)致，那么細(xì)胞膜物理完整性會(huì)立即喪失后，可通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色法可以檢測(cè)到。這表明，冷凍復(fù)蘇細(xì)胞培養(yǎng)期間出現(xiàn)的細(xì)胞活性下降，并非因IIF對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)物理?yè)p傷引起 [8] 。

解凍復(fù)蘇時(shí)鏡下細(xì)胞結(jié)構(gòu)保持完整性的細(xì)胞，正常培養(yǎng)期的前72小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)的大量壞死的現(xiàn)象，研究人員稱之為延遲性細(xì)胞死亡（delayed-onset cell death） ^[27]或冷凍保存誘導(dǎo)的延遲性細(xì)胞死亡（cryopreservation-induced delayed-onset cell death, CIDOCD） ^[28] 。

       大量實(shí)驗(yàn)報(bào)告中，都可找到冷凍保存細(xì)胞的延遲性細(xì)胞死亡的痕跡，只不過(guò)是細(xì)胞死亡比率高低不同或死亡率處于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可接受范圍。說(shuō)明這一現(xiàn)象具有一定普遍性。由于通常在復(fù)溫后的前24-48小時(shí)內(nèi)逐漸顯現(xiàn)，很容易被忽視，造成人們對(duì)特定實(shí)驗(yàn)方法中細(xì)胞實(shí)際恢復(fù)率的高估。深入了解與冷凍保存誘導(dǎo)的分子細(xì)胞死亡相關(guān)的途徑與機(jī)制，有針對(duì)性地開發(fā)出可降低延遲性細(xì)胞死亡的細(xì)胞保存材料和優(yōu)化冷凍保存策略，對(duì)冷凍保存后的細(xì)胞高回收率具有重要意義。

       紐約州立大學(xué)細(xì)胞和分子生物家兼BioLife生物技術(shù)公司創(chuàng)始人約翰?M?鮑斯特（John M. Baust），從1998年開始關(guān)注延遲性細(xì)胞死亡現(xiàn)象。多種細(xì)胞死亡信號(hào)通路的激活往往需要在復(fù)蘇并轉(zhuǎn)入正常培養(yǎng)數(shù)小時(shí)至數(shù)天才陸續(xù)顯現(xiàn)。細(xì)胞病理性壞死性（譬如，解凍后6小時(shí)）和基因程序性凋亡（解凍后12小時(shí)）具有明顯延遲發(fā)作特征。而這一過(guò)程與細(xì)胞冷凍保存后死亡的時(shí)間特性相符。因此，鮑斯特指出，傳統(tǒng)慢速冷卻保存方法保存的MDCK細(xì)胞，在解凍后活細(xì)胞數(shù)量在最初24小時(shí)內(nèi)持續(xù)下降，是由于延遲性壞死與凋亡性細(xì)胞死亡共同作用所致。解凍后立即出現(xiàn)的caspase活性初始升高（6小時(shí)）代表內(nèi)源性前caspase的募集與激活過(guò)程，解凍21小時(shí)左右檢測(cè)到的延遲峰值，是caspase依賴性凋亡信號(hào)放大導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)的結(jié)果。通過(guò)在冷凍保存液加入caspase-1凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑，能降低延遲死亡，提升解凍后的細(xì)胞存活率 ^[27] ，驗(yàn)證了這一推測(cè)。研究顯示，提高caspase-1凋亡信號(hào)通路抑制劑的濃度并不能額外提升存活率，而且單獨(dú)添加caspase-1通路抑制劑并不能完全阻斷冷凍保存后的細(xì)胞凋亡。分析，凋亡是由于凍融過(guò)程中存在多種內(nèi)、外源凋亡激活通路誘導(dǎo)途徑激活產(chǎn)生的。

       目前認(rèn)為，在低溫冷凍保存過(guò)程中細(xì)胞損害機(jī)制中，除了冰晶本身對(duì)細(xì)胞功能結(jié)構(gòu)的機(jī)械物理?yè)p傷、溶液高滲透壓（Hyperosomolality）應(yīng)激外，還存在氧化應(yīng)激、低溫凍傷、CPA毒性等多種誘因。損傷部位包括細(xì)胞膜相變（Membrane Phase Transitions）、細(xì)胞骨架解體（Cytoskeletal Disassembly）、細(xì)胞核和線粒體等多種器質(zhì)性損傷，受損生物分子涉及蛋白酶、脂質(zhì)和核酸，細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)離子失衡、蛋白質(zhì)變性（Protein Denaturation）、自由基生成等生物化學(xué)過(guò)程，以致于細(xì)胞能量代謝、發(fā)育、增殖等生物活動(dòng)過(guò)程受擾，細(xì)胞最后以延遲性死亡形式表現(xiàn)出來(lái) ^[29] 。

       現(xiàn)在看，這一過(guò)程所涉及的維度之廣、機(jī)制之復(fù)雜，絕非可以用細(xì)胞凋亡信號(hào)通路激活理論就能全部概括。應(yīng)該效仿盧耶特那樣，借鑒物理化學(xué)定律，從低溫保護(hù)劑、水分子化學(xué)屬性與細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能間的內(nèi)在聯(lián)系的角度來(lái)考察，似乎更容易接近真相。

 （待續(xù)）