（續(xù)：從冷凍保護劑的化學(xué)特性看細胞延遲性死亡的應(yīng)對策略-上）

二、水的分布與細胞結(jié)構(gòu)和功能的密切聯(lián)系

       細胞內(nèi)水分子有兩種形態(tài)，一種是自由水，另一種是結(jié)合水。兩種形態(tài)的水在細胞中各自有其獨特生理作用。維持胞內(nèi)兩種形態(tài)水的平衡，對于維持細胞生理功能和結(jié)構(gòu)的正常至關(guān)重要。

2.1 自由水的分布

       自由水即體相水（Bulk water）或稱為游離水（Free water），是指沒有與細胞組成結(jié)構(gòu)、分子、離子等組分結(jié)合的水，可通過滲透、擴散、主動轉(zhuǎn)運等多種機制自由進出細胞膜和細胞器，是細胞養(yǎng)料和代謝廢物傳輸載體，參與酶活性催化、基因表達調(diào)控和信號傳導(dǎo)等生命活動，還是水解反應(yīng)、離子水合作用等生化反應(yīng)的底物。

2.2 結(jié)合水的定位

       結(jié)合水是指分布在蛋白質(zhì)、核酸或脂質(zhì)等生物大分子、各種離子結(jié)合的水分子層。受離子靜電作用、氫鍵、范德華力、長程庫侖力（long-range Coulomb forces）和疏水作用力（hydrophobic forces）等因素節(jié)制，這部分水無法自由擴散 ^[30] 。20世紀50年代發(fā)現(xiàn)生物分子結(jié)合水存在后, 大量研究證明生物結(jié)合水是生命活動中不可或缺的有機組成部分，在維護生物大分子的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性以及調(diào)控動力學(xué)性質(zhì)和生理功能等方面起著決定性的作用。

       生物結(jié)合水分為三種類型：（1）溶劑殼（solvation shell），又稱溶劑化層，是指在溶質(zhì)與溶劑間的靜電作用、氫鍵、范德華力等相互作用下，由溶劑分子有序排列包圍溶質(zhì)粒子形成溶劑殼。殼結(jié)構(gòu)通常包括第一溶劑殼層和第二溶劑殼層。第一溶劑殼層由直接與溶質(zhì)離子配位的溶劑分子組成，而第二溶劑化殼層則包含受溶質(zhì)離子影響但未直接配位的溶劑分子或離子對。水溶液中形成的是水合殼。細胞內(nèi)部大量無機離子、生物大分子的荷電基團因靜電效應(yīng)，吸引水分子圍繞其周圍徑向排列，形成與離子或離子基團締合的水合殼。離帶電粒子近的水合層中水分子排列有序，層級向外拓展則水分子排列有序性降低。此外，Na+、Ca2+等小離子則可能嵌入水分子晶格中。（2）生物分子中的極性基團則與水通過氫鍵相互作用形成極性水合層。（3）非極性基團疏水作用會增強水分子間相互作用，圍繞大分子成疏水水合層。在緊密纏繞的分子鏈間隙中，水分子嵌入形成稱為毛細管水的結(jié)合水。

       與蛋白質(zhì)結(jié)合水分子分為表面水合作用和內(nèi)部水合作用兩種。在蛋白質(zhì)的表面，水分子會與極性和帶電的基團形成氫鍵或靜電相互作用而圍繞在蛋白質(zhì)表面，形成一個動態(tài)的水合殼層。研究顯示，不同個體、不同類型的細胞，有3%比例的結(jié)合水包裹在可溶蛋白質(zhì)周圍，形成厚度相當(dāng)于一層水分子厚的殼。跟普通的體相水相比，這一水殼內(nèi)部氫鍵結(jié)構(gòu)較弱，水分子排列無序程度接近于水蒸汽 ^[31] 。而蛋白質(zhì)內(nèi)部的水分子則通常位于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)空腔或裂縫中。因空間維度、孔隙尺寸、界面性質(zhì)(親疏水性、剛性柔性等)、外界環(huán)境(溫度、壓力、電場等)的條件限制，生物結(jié)合水部分的氫鍵的數(shù)量和結(jié)構(gòu)變化與體系水不同，決定了其不同于體相水的理化特性 ^[32] 。

       蛋白質(zhì)與水分子形成的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，推動蛋白質(zhì)進入折疊狀態(tài)并維持其二級、三級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定 ^[33] 。而疏水作用力驅(qū)動著蛋白分子中疏水基團聚集和蛋白質(zhì)折疊。許多蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象動態(tài)變化與水分子的介入程度有關(guān)。蛋白質(zhì)水合作用必須達到一定程度才能發(fā)揮正常功能活性。某些蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)還因水含量不同而異。幾個關(guān)鍵靶位結(jié)合水分子數(shù)的變化，會引起聚賴氨酸及聚谷氨酸等同族多肽的構(gòu)象發(fā)生α→β→γ間的轉(zhuǎn)變。譬如胰島素，必須在水膜引導(dǎo)下才能形成能降血糖的三維結(jié)構(gòu)。膠原蛋白單螺旋之間的水橋是維持三股螺旋結(jié)構(gòu)的必要條件。蛋白質(zhì)水合過程，調(diào)控著蛋白質(zhì)離子通道開關(guān)、蛋白-蛋白識別、配體和藥物結(jié)合、酶催化等生物過程 ^[34] 。

       實際上，細胞膜脂膜雙層結(jié)構(gòu)、核酸、胞內(nèi)多糖、脂質(zhì)等生物大分子和帶電粒子，皆因水合作用而維持特定的三維構(gòu)象和功能活性。

2.3 細胞生命活動對水的調(diào)節(jié)

       蛋白質(zhì)自身功能活動可調(diào)控兩種形態(tài)水的分布和平衡。超過1/3的真核蛋白質(zhì)中存在被稱為“固有無序區(qū)（intrinsically disordered region, IDR）”的特殊結(jié)構(gòu)氨基酸片段。它們與其他具有基因表達調(diào)控功能的生物因子間的結(jié)合，并非基于傳統(tǒng)蛋白間三維構(gòu)型匹配關(guān)系，而是由氨基酸序列的化學(xué)性質(zhì)（如電荷、疏水性等）驅(qū)動。研究表明，在低滲環(huán)境和/或高溫條件下，蛋白質(zhì)會溶入胞質(zhì)而暴露出IDR，水分子與IDR的結(jié)合后，使局部自由水分子數(shù)量減少。相反，在高滲環(huán)境和/或低溫條件下，蛋白質(zhì)凝聚，IDR與相應(yīng)大生物分子結(jié)合而并釋放所結(jié)合的水分子，使細胞內(nèi)局部自由水分子增加。蛋白質(zhì)在不同功能活動狀態(tài)下構(gòu)象的轉(zhuǎn)換，可調(diào)節(jié)維持結(jié)合水和自由水的平衡以有效應(yīng)對環(huán)境脅迫 ^[35] 。

       生物體內(nèi)，結(jié)合水與自由水會隨著環(huán)境溫度變化、細胞所處環(huán)境滲透壓和細胞新陳代謝活動水平而相互轉(zhuǎn)換。溫度升高，則結(jié)合水釋放成為自由水，自由水比例的增加，意味著生物體新陳代謝活躍。而溫度降低，自由水大量轉(zhuǎn)化為結(jié)合水，新陳代謝活動因此而放緩。當(dāng)自由水含量的異常波動，將造成細胞內(nèi)兩種形態(tài)水分布的失衡，可對細胞結(jié)構(gòu)與功能調(diào)控產(chǎn)生廣泛影響。

三、冷凍保護劑的應(yīng)用對細胞結(jié)構(gòu)與功能的影響

       1965年的美國低溫生物學(xué)會（Society for Cryobiology）年會上，學(xué)者們一致認為，動物細胞在冷凍時需要至少用一種低溫保護劑（cryoprotectant）或低溫防護劑（ryoprotective agent, CPA）對細胞進行特定處理才能使細胞存活。而甘油和二甲基亞砜（DMSO）作為保護劑的發(fā)明和使用，是低溫生物學(xué)技術(shù)發(fā)展里程的分水嶺。

       細胞冷凍保存過程中，CPA的保護作用形成機制，一般認為可能與包括氫鍵調(diào)節(jié)、細胞膜特性改變、溶液稀釋效應(yīng)及溶液增加粘度等多重因素的協(xié)同作用有關(guān) ^[6] 。

3.1 CPA與水分子間氫鍵的生成和影響

       分子間氫鍵廣泛存在于化學(xué)、生物、材料等分子體系中, 在分子識別、維持蛋白質(zhì)二級和三級折疊構(gòu)象、DNA螺旋結(jié)構(gòu)形成、分子自組裝等方面發(fā)揮重要作用。包括甘油、DMSO、乙二醇、PG等小分子膜滲透型CPA，均可通過羥基、甲基或亞砜基等極性基團，與水分子、蛋白、脂質(zhì)成份形成氫鍵，改變細胞內(nèi)部水的氫鍵網(wǎng)絡(luò) ^[14] 。

       羥基(-OH)是參與分子間氫鍵的重要化學(xué)基團之一。乙二醇由兩個亞甲基和兩個羥基構(gòu)成，在乙二醇溶液中至少存在兩種形式的分子間氫鍵，一種是水-EG分子間的強氫鍵相互作用，另一種是EG分子間氫鍵 ^[36] 。甘油則能參與6-12個氫鍵的形成，其與水形成的氫鍵壽命均長于水-水或甘油分子間的氫鍵。DMSO分子具有一個親水的亞硫?；O性基團）和兩個疏水的甲基（非極性基團），與水之間會產(chǎn)生強偶極-偶極和氫鍵相互作用。DMSO的亞砜基與水分子形成氫鍵強度遠高于水分子間形成的氫鍵強度，DMSO-水間氫鍵壽命水分子間氫鍵壽命的數(shù)倍 ^[37] 。體相水中氫鍵網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)變化屬性，為在相對稀釋的CPA溶液中，CPA與水分子間的強大的氫鍵相互作用替代部分原有水-水氫鍵網(wǎng)絡(luò)提供便利，增強了溶液水分子氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu) ^[38] 。

       而CPA通過氫鍵吸引水分子生成的溶劑化殼層，則可調(diào)節(jié)胞內(nèi)水分子排列和分布。譬如H?O/DMSO溶液中，微觀液–液相分離形成納米級的DMSO分子簇和水分子團簇。由于DMSO強極性作用，DMSO溶劑殼中對第一溶劑化殼層之外的殼層水分子約束更強，殼體系的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，體相水中水分子“被鎖定”在DMSO水殼層體系內(nèi)，胞內(nèi)體相水份額減少，故可抑制自由水分子簇和四面體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的生成 ^[39] 。水分子圍繞CPA分子的強水合作用，與圍繞細胞質(zhì)膜、蛋白、核酸等細胞成分發(fā)生的水合作用存在競爭關(guān)系。隨著CPA濃度增加，越來越多水分因進入CPA分子的水合層，體相水分子被持續(xù)大量消耗，削弱了個細胞組分的水合作用 ^[40] 。CPA分子極性越強，對水親和力大，與蛋白等細胞組分間水合作用的競爭中就越有利。吸引胞內(nèi)組分外圍水分子逐步解離流失，胞內(nèi)自由水、結(jié)合水分子重新轉(zhuǎn)移分配，危及細胞膜、細胞器質(zhì)膜和胞內(nèi)區(qū)室中生物活性大分子正常構(gòu)象的穩(wěn)定性。

       強極性膜滲透型CPA分子與細胞各組分之間水合作用競爭沖突在細胞內(nèi)廣泛存在，只是不同生物分子、不同功能結(jié)構(gòu)在水合競爭沖突受損程度不同而已。通常，該組分與水分子結(jié)合力越弱，越容易受CPA水合作用干擾，功能越容易受損。CPA暴露引發(fā)細胞內(nèi)水份流失，加上CPA水合作用競爭，造成胞內(nèi)自由水與結(jié)合水分布失衡，干擾DNA、蛋白質(zhì)及其他大分子活性構(gòu)型，會導(dǎo)致各種細胞器的結(jié)構(gòu)完整性遭受不同輕重不同的損害 ^[3] 。

       關(guān)于CPA與蛋白相互作用對蛋白功能構(gòu)象的影響，目前意見不一致。蛋白質(zhì)表面上的疏水或氫鍵相互作用不足以產(chǎn)生壽命超過幾納秒的DMSO?蛋白復(fù)合物，推測低濃度(<10%）不會對折疊蛋白的結(jié)構(gòu)或穩(wěn)定性產(chǎn)生顯著影響。但DMSO濃度變化會對溶劑粘度產(chǎn)生顯著影響。在DMSO體積比0–20%濃度（相當(dāng)于摩爾分數(shù)為0–0.06）區(qū)間，溶液粘度隨DMSO含量的增加線性提升超過3倍。粘度增大會造成蛋白旋轉(zhuǎn)、擴散、聚合所需時間發(fā)生明顯變化，干擾蛋白與配體結(jié)合和跨膜轉(zhuǎn)運能力 ^[41] 。根據(jù)蛋白分子中的IDR序列的分子識別與相互作用機制，我們更有理由相信，CPA干擾了水中氫鍵網(wǎng)絡(luò)構(gòu)象，會對IDR的基因表達調(diào)控功能帶來不利影響。

3.2 CPA對細胞膜功能結(jié)構(gòu)的影響

       生物膜是指細胞本身及胞質(zhì)內(nèi)葉綠體、細胞核、線粒體、高爾基體、液體泡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器與外界相隔的雙分子層狀膜結(jié)構(gòu)，充當(dāng)著細胞內(nèi)外環(huán)境的屏障，主要成分為磷脂。磷脂是雙親性分子，頭部為1個極性親水頭，借助氫鍵和周圍水分子相互作用；尾部為2個脂肪酸鏈，通過疏水作用彼此接觸。不同類型生物膜中脂質(zhì)、蛋白質(zhì)的組成比例存在差異，代表了膜功能的多樣性。通常，膜和所在細胞器功能越復(fù)雜，則蛋白質(zhì)含量越高；功能越簡單，蛋白質(zhì)含量越低。

       磷脂雙分子層狀膜結(jié)構(gòu)的內(nèi)外表面都是親水的，所以在水環(huán)境中能穩(wěn)定存在，借助于膜透性吸收水，還能保持胞內(nèi)含有適量的水。膜脂的流動性是指膜脂處于液晶態(tài)，磷脂脂分子能進行多種運動。膜流動性的維持需適當(dāng)水合作用與和適宜的溫度條件。局部水環(huán)境變化導(dǎo)致膜流動性降低，將直接影響跨膜運輸功能，損害細胞生理活動。

       研究發(fā)現(xiàn)，濃度低于≤7.5mol % DMSO水溶液中，DMSO通過將水分子與脂質(zhì)表面解耦（表面脫水），提高凝膠相DPPC（二棕櫚酰磷脂酰膽堿）模型雙層表面的水分子擴散率，將結(jié)合的水分子釋放到體相水中，降低膜雙層間排斥力（包括橫向和雙層間）的作用范圍和強度，應(yīng)對在冷凍水結(jié)晶時對膜結(jié)構(gòu)應(yīng)變 ^[42-43] 。當(dāng)DMSO濃度超過50%（重量體積比）時，DMSO能夠破壞層狀液晶相的穩(wěn)定性，降低了分子間的固有排斥力，促使這些磷脂分子更傾向于形成穩(wěn)定凝膠相。但凝膠相與晶體相穩(wěn)定化特性或許能解釋高濃度DMSO的細胞毒性作用。

       DMSO通過降低雙層-溶劑界面間的排斥力，有效縮小了雙層之間的間距，影響溶質(zhì)跨生物膜被動滲透作用。溶質(zhì)跨膜被動滲透動力學(xué)關(guān)系可用公式J = -Dβ/l(△C)表示。l代表膜厚度，即擴散路徑長度。J表示溶質(zhì)沿濃度梯度方向,即濃度梯度△C遞減方向的凈通量。D為膜內(nèi)溶質(zhì)擴散常數(shù)。β是溶質(zhì)在膜水相與碳氫化合物相間的分配系數(shù)。l縮短將有效提升溶質(zhì)擴散通量。另一個可能受DMSO影響的因素是分配系數(shù)。DMSO在界面區(qū)域的定位將影響溶質(zhì)從水相向膜疏水域轉(zhuǎn)移的活化能。極性溶質(zhì)DMSO從膜界面處溶質(zhì)中移除水合水分子，可能導(dǎo)致被動擴散的活化能顯著降低。

       采用分子動力學(xué)模擬方法，對膜滲透型CPA分子對生物膜脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)、動態(tài)及功能影響的研究表明，在乙二醇、丙二醇和甘油等醇類物質(zhì)存在時，醇類與脂質(zhì)頭基之間的氫鍵取代了原有的水-脂鍵，脂質(zhì)頭基發(fā)生部分脫水，導(dǎo)致雙層膜的橫向擴展和變薄。CPA能以濃度依賴方式調(diào)控生物膜通透性。體積分數(shù)5%濃度的DMSO會降低細胞膜厚度，增加膜的滲透性。在常規(guī)使用濃度(10%體積分數(shù)）下，DMSO會誘導(dǎo)水孔形成，促使CPA分子取代水分。當(dāng)DMSO濃度升高至更高且更具毒性的水平(40%體積分數(shù)）時，還會破壞磷脂雙分子層結(jié)構(gòu) ^[44] 。據(jù)報道，DMSO會破壞磷脂膜水合作用，破壞細胞膜、核膜、線粒體膜的結(jié)構(gòu)完整性 ^[45] 。研究證實，膜穿透型CPA可能是導(dǎo)致線粒體膜變化，電子泄漏(electron leakage)和活性氧（reactive oxygen species, ROS)）增加，產(chǎn)生細胞器特異性毒性 ^[46] 。

（后續(xù)：從冷凍保護劑的化學(xué)特性看細胞延遲性死亡的應(yīng)對策略-下）